脊椎动物博物馆标本历史DNA降解的比较研究：液浸保存标本的意外价值

《Molecular Ecology Resources》：A Comparative Survey of Historical DNA Degradation From Vertebrate Museum Specimens: Unexpected Utility of Fluid-Preserved Specimens

　　

： 博物馆基因组学（museomics）的进展已从干燥和骨骼标本扩展至液浸保存材料作为DNA来源。然而，对标本间和组织类型间DNA降解模式的理解仍然有限，阻碍了从博物馆凭证标本中选择最优DNA来源的论证。本研究量化了不同分类群（两栖类、有鳞类（squamates）和鸟类）和组织类型的DNA质量，以基准评估液浸保存标本与更常用来源（冷冻组织、干燥皮肤和骨骼）相比的DNA产量、片段化程度、内源含量（endogenous content）和DNA损伤。测试表明，液浸保存材料具有更小的片段、降低的内源含量以及随年龄增加的脱氨作用（deamination），表明即使在短时间内也存在广泛降解。出乎意料的是，福尔马林固定（formalin-fixed）的液浸保存标本未显示出DNA产量或片段长度随标本年龄的明显下降，提示福尔马林固定最初使DNA片段化，但可能部分解耦了随后的片段长度模式与标本年龄的关系。液浸保存标本中不同组织类型的DNA产量、片段大小和内源含量均表现出时间和组织类型依赖的模式。在较年轻标本中，肝脏DNA质量指标最高，但在最古老标本中表现较差。在较老标本中，各分类群的最优组织类型包括皮肤、肌肉或骨骼。然而，相同制备类型和年龄的个体标本之间存在显著变异，表明采集历史也影响DNA降解。本比较分析强化了早期发现，即所有年龄的液浸保存标本都是可行的DNA来源。研究人员利用这些发现来优化DNA采样策略，以将液浸保存凭证标本纳入博物馆基因组学研究。

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一、研究背景与问题

博物馆基因组学（museomics）——即从自然历史收藏中生成组学数据——已成为自然历史收藏的重要应用方向。传统保存方法在机构间和分类群间差异显著，涵盖完整生物体（如针插昆虫和液浸保存材料）到部分凭证标本（如皮肤、骨骼、压制植物部分以及近年专门为生物分子分析保存的组织）。冷冻组织库理想适用于遗传研究，但仅在过去50年才出现，限制了其时间记录。DNA提取技术的进步和高通量测序的发展拓宽了可用凭证标本的范围，使从自然历史收藏中获取全基因组、群体基因组甚至表观遗传数据成为可能。然而，从凭证标本提取的DNA通常高度降解，表现为片段化增加和易受外源污染，被称为历史DNA（hDNA）。干燥皮肤、标本和骨骼材料是最广泛使用的可靠hDNA来源，但存在显著的分类学偏差——主要以哺乳动物和鸟类为主，而液浸保存为主要制备方式的两栖类、非鸟类爬行动物和鱼类在博物馆基因组学研究中代表性严重不足。

液浸保存标本的DNA提取已取得实质性进展，但成功率可能仍然较高且缺乏一致的预测趋势。福尔马林固定造成的损伤和交联，加上液浸保存标本通常未知的固定历史，被认为是液浸保存标本用于博物馆基因组学研究的最大障碍。尽管保存历史差异巨大，尚无研究明确比较不同液浸保存凭证标本中不同组织类型在保存方法和时间上的表现，并与不同保存条件的其他博物馆凭证标本进行比较。由于缺乏历史DNA质量的比较实验数据，研究人员无法确信研究者正从博物馆凭证标本中定位最优DNA来源。

二、研究内容与结论

为填补这一知识空白，研究人员比较了脊椎动物（两栖类、有鳞类和鸟类）自然历史收藏中典型凭证类型的DNA提取和测序指标：（1）冷冻组织；（2）干燥皮肤；（3）骨骼；（4）液浸保存标本（酒精固定和福尔马林固定），以测试不同凭证类型是否在档案条件下与不同DNA降解特征相关。同时比较了来自同一酒精或福尔马林固定凭证标本的皮肤、肌肉、肝脏和骨骼的提取和测序指标。研究共获得美国自然历史博物馆脊椎动物学收藏的132个标本，包括70个鸟类标本和62个两栖爬行类标本，年龄从3到152年不等（采集于1872年至2021年），分为年轻（1980年后采集）和年老（1980年前采集）两组。

研究结果显示，所有博物馆标本无论凭证类型均可提取到可测量的DNA。凭证类型和分类群对所有响应变量有显著影响，凭证类型在所有四个响应变量上具有大效应量。冷冻组织保留了最高数量、最长片段长度和最高比例的内源DNA。干燥皮肤在年老标本中仍比液浸保存标本具有更高的DNA产量和更大的片段大小。液浸保存材料具有更小片段、降低的内源含量和随年龄增加的脱氨作用。出乎意料的是，福尔马林固定标本未显示DNA产量或片段长度随标本年龄的明显下降，表明福尔马林固定最初使DNA片段化但可能部分解耦了随后的片段长度模式与标本年龄的关系。组织类型表现高度依赖分类群、固定剂和年龄：肝脏在年轻标本中产量最高但在最老标本中表现较差，年老标本中最优组织类型包括皮肤、肌肉或骨骼。相同制备类型和年龄的个体标本间存在显著变异，表明采集和档案历史也影响DNA降解。

三、关键技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法：从美国自然历史博物馆脊椎动物学收藏获取132个标本，涵盖鸟类（干燥皮肤42个、福尔马林固定液浸标本22个、酒精固定液浸标本6个）和两栖爬行类（干燥骨骼10个、福尔马林固定液浸标本29个、酒精固定液浸标本23个）。DNA提取采用改良的Qiagen DNeasy Blood & Tissue方案配合QIAquick离心柱以改善短DNA片段的回收。DNA产量通过Qubit荧光测量，片段长度分布通过Agilent TapeStation系统分析。所有现代和历史DNA提取物均使用BEST方案制备文库，在Illumina平台进行150bp双端测序。测序数据使用EAGER流程处理，包括接头去除、双端读段合并、质量过滤、BWA比对到核基因组和线粒体参考基因组、PCR重复去除，并使用DamageProfiler评估胞嘧啶脱氨损伤，内源含量通过endorS.py估计。统计分析使用R平台的广义线性模型，并进行Tukey调整的事后成对比较。

四、研究结果

3.1 不同凭证标本的DNA数量和质量

冷冻组织保留了最高数量、最长片段长度和最高比例的内源DNA。年轻鸟类皮肤倾向于比冷冻组织和所有其他凭证类型保留更高量的DNA，但片段长度显著小于冷冻组织。在所有同时具有年轻和年老标本的凭证类型中，年老标本保留更少DNA且片段更小。在两类液浸保存标本中，年老和年轻标本间的内源含量比例无显著差异。干燥皮肤即使在年老标本中也比液浸保存标本具有更高的DNA产量和更大的片段大小。液浸保存标本中DNA降解增加进一步反映在测序读段5′端胞嘧啶错配增加上。冷冻组织和干燥皮肤表现出最低的胞嘧啶错配水平；所有情况下年老标本表现出更高的错配水平。

3.2 DNA随时间的变化

干燥皮肤中DNA产量和片段大小随年龄增加明显减少；年轻皮肤（小于30年）常规恢复大于1000bp的片段长度，而年老标本高度片段化，片段长度常低于300bp。酒精固定标本中DNA产量和片段长度随时间明显下降，但回归斜率显著低于干燥皮肤，表明随时间关联的分解。福尔马林固定标本中这种时间依赖的解耦进一步夸大，年轻和年老标本间DNA产量和片段长度无显著差异。与DNA产量、片段长度和内源含量随时间关系减弱相反，胞嘧啶错配随时间的关系增强，尤其在液浸保存标本中。采集日期解释了干燥皮肤标本中DNA产量和片段长度变异的比例高于酒精或福尔马林固定标本。

3.3 冷冻和凭证标本的配对比较

在几乎所有指标上，凭证标本表现差于冷冻组织，具有更小DNA片段、降低的内源含量（仅在福尔马林固定标本中显著）和读段末端C到T转换增加。干燥皮肤中，趾垫倾向于比冷冻对应物保留更高DNA产量，尽管不显著。

3.4 液浸保存标本中的组织表现

酒精固定标本中，肝脏在年轻标本中保留最高DNA量，而年老标本中无单一组织优于其他组织。肌肉在年轻和年老标本中均倾向于保留更大DNA片段。皮肤在年轻和年老标本中均倾向于保留更高内源DNA量。福尔马林固定标本中，年轻标本中肝脏获得更高DNA产量，年老标本中皮肤获得更多DNA。年老标本中肝脏倾向于获得更小片段。皮肤样本倾向于获得更高内源含量比例，年轻标本中骨骼和皮肤获得更多内源含量，肌肉和肝脏获得较少。皮肤在年老标本中倾向于具有降低的胞嘧啶脱氨水平。

五、讨论与结论

研究证明液浸保存标本——特别是酒精保存甚至一些较老福尔马林固定标本——可产生大量DNA，其中一部分产生高内源含量（>70%）和足够大的片段用于全基因组分析。肝脏被确定为年轻标本的最佳DNA来源，而皮肤和肌肉在年老标本中更可靠，取决于分类群和固定剂。然而，相同制备类型和年龄的个体标本间存在显著变异，表明标本的采集和档案历史可能对DNA降解产生重大影响。

福尔马林固定标本中缺乏时间依赖的DNA片段化是最显著的结果之一，表明大部分观察到的DNA片段化发生在固定早期。这与此前FFPE研究一致，显示福尔马林暴露初期阶段发生大量DNA片段化。福尔马林诱导的交联可能稳定核酸免受进一步的酶促或水解降解。尽管DNA产量、片段长度和内源含量的时间依赖趋势在福尔马林固定标本中分解，胞嘧啶脱氨仍与标本年龄保持明确正相关，反映了水解损伤随时间的持续积累。

肝脏在年老液浸保存标本中表现较差，与新鲜采集肝脏组织快速死后降解一致，可能归因于高酶活性和自溶。肌肉产量较低但常保留更大DNA片段，且肌肉样本往往比其他组织类型更抗DNA降解。这些结果强调采样液浸保存标本时需考虑年龄和保存方法。

采样建议方面，皮肤和肌肉——比骨骼采样侵入性更小——成为肝脏的有力替代方案，尤其在年老标本或保存历史不确定时。同时采样皮肤和下层肌肉可能提供改善历史DNA恢复的实用方法。由于许多历史文库以短插入和可变内源含量为主，试测序对于估计标本最适合浅层筛选、线粒体基因组组装、靶标捕获或更深鸟枪测序仍然重要。

结论部分指出，通过识别各种保存方法和年龄下最可靠的DNA提取组织，研究提供了一个优化采样策略的框架，平衡最大化提取成功与标本保护。冷冻组织仍是最优DNA保存来源，但干燥皮肤、骨骼和液浸保存标本均可产生有用的遗传数据，扩展博物馆基因组学研究的时空和分类学范围。液浸保存标本，包括福尔马林固定材料，不应被视为统一的差DNA来源。组织选择很重要：肝脏可能是年轻液浸保存标本的合适靶标，但其性能在年老材料中下降，皮肤和肌肉通常提供更好的替代方案。鉴于相似年龄和保存类型标本间的显著变异，初始筛选、尽可能重复采样以及改进野外和采集历史的记录，对于最大化恢复同时最小化破坏性采样仍然重要。这些发现强化了传统凭证标本（包括液浸保存材料）作为未被充分利用但可行的博物馆基因组学研究资源的价值。