《Molecular Genetics & Genomic Medicine》：Analysis of Whole Exome Sequencing Results of Type 2 Diabetic Pedigree
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摘要翻译
背景：2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）表现出强烈的家族聚集性。本研究旨在鉴定一个T2DM高发中国人家系中潜在的致病基因和突变位点。
方法：研究纳入了一个包含20名成员的多代家系，其中5名成员确诊为T2DM。
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背景：2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）表现出强烈的家族聚集性。本研究旨在鉴定一个T2DM高发中国人家系中潜在的致病基因和突变位点。
方法：研究纳入了一个包含20名成员的多代家系，其中5名成员确诊为T2DM。先证者为第二代女性，病程10年。研究人员采集外周血，从血细胞中提取基因组DNA，并进行全外显子测序（Whole Exome Sequencing，WES）。结合KEGG通路映射等生物信息学分析，筛选候选致病变异。
结果：测序共发现485个DNA变异，经过滤后得到16个高优先级突变（15个单核苷酸多态性[SNP]和1个插入缺失[Indel]）。通过文献回顾和功能通路分析，两个杂合突变——EPHX3 rs760409070 [c.778G>A，p.Glu260Lys]和FHOD1 rs142023201 [c.1493A>G，p.Asn498Ser]——被鉴定为候选致病变异。这两个突变在所有受累家庭成员中均存在。
结论：EPHX3 rs760409070和FHOD1 rs142023201突变可能是该家系T2DM的易感遗传因素。基于生物信息学分析，研究人员推测这些突变可能通过降低外周胰岛素敏感性、损害葡萄糖摄取、抑制糖原合成及增强糖异生而促进糖尿病发病机制。
论文主体内容解读
2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种由环境因素和遗传因素共同作用的复杂疾病，其全球成人（20–79岁）患病率在2021年为10.5%，预计到2045年将增至12.2%。T2DM具有显著的家族聚集性，遗传因素在发病中起重要作用。目前已通过全基因组关联研究（Genome-wide association study，GWAS）鉴定出数百个T2DM易感基因，但不同种族或不同家系之间存在明显的遗传异质性。全外显子测序（Whole Exome Sequencing，WES）能高效捕获外显子区域的低频和稀有突变，已成为复杂疾病分子机制研究的有力工具。然而，此前尚无利用WES技术在中国云南省T2DM家系中筛查致病基因的研究报道。因此，研究人员对一个T2DM高发家系进行WES及生物信息学分析，旨在鉴定与该家系强烈家族聚集性相关的潜在致病基因和突变位点，为家族性T2DM的预防、诊断和治疗提供线索和理论依据。
研究人员纳入一个来自中国云南的多代T2DM家系，共20名成员，其中5名成员确诊为T2DM（G1、G2、G4、G5、G7），先证者为第二代女性，病程10年。通过全外显子测序和系统生物学分析，最终筛选出两个候选致病性杂合突变：EPHX3 rs760409070 [c.778G>A，p.Glu260Lys]和FHOD1 rs142023201 [c.1493A>G，p.Asn498Ser]。这两个突变在所有受累家庭成员中均存在，而在正常对照中不携带。研究提示，上述突变可能通过降低外周组织胰岛素敏感性、减少葡萄糖摄取、抑制糖原合成和促进糖异生，从而促进T2DM的发生。该发现丰富了T2DM家系的致病基因谱，为后续功能验证和个体化防治提供了候选靶点。
研究人员采用以下主要关键技术方法：采集家系20名成员的外周血并提取基因组DNA，使用BGISEQ-500平台进行全外显子测序（SureSelect Human All Exon V6试剂盒捕获外显子）。随后开展多步骤生物信息学分析：基于突变在家系中的共分离情况计算突变概率Pv值；利用qqman软件包绘制Manhattan图，筛选显著的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）和插入缺失（Insertion-deletion，Indel）位点；以次要等位基因频率（Minor Allele Frequency，MAF）<0.001进一步过滤，并通过genemania将候选基因映射至京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路，分析基因互作网络及潜在致病机制；最后使用Ensembl Variant Effect Predictor（VEP）进行计算机功能预测，并查阅gnomAD、ClinVar、GWAS Catalog等公共数据库进行注释。样本来源为中国云南一个汉族T2DM家系。
研究结果分述如下。
3.1 DNA样品质量评估：通过Qubit荧光定量检测DNA浓度和总量，以≥1 μg为标准，同时采用1%琼脂糖凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis，AGE）评估完整性。结果显示，20份DNA样品均达到测序质量要求。
3.2 外显子测序质量：对20份DNA样品进行全外显子测序，每份样品平均获得原始碱基14,890.66 Mb，去除低质量读段后平均获得148,819,404条clean reads（14,873.84 Mb），平均GC含量为52.14%。各样品的Q20与Q30均较高，表明测序数据质量良好，可进行后续分析。
3.3 突变检测统计：所有样品平均检测到96,114个SNP位点，编码区包含11,002个同义突变和10,381个错义突变；另外还发现32个终止密码子变为非终止密码子、94个非终止密码子变为终止密码子、19个起始密码子变为非起始密码子，以及93个剪接位点突变。平均检测到15,142个Indel位点，编码区含308个移码突变。
3.4 生物信息学分析：根据突变在家系中的分布，筛选出所有患者携带、正常对照不携带，且第三代直系亲属携带频率≤50%的485个突变位点（429个SNP、56个Indel）。通过Manhattan图展示显著位点，经功能注释和MAF<0.001过滤后，最终获得16个高优先级突变（15个SNP和1个Indel），涉及16个基因，包括EPHX3、SLC52A1、HCN4、ACSBG1、FHOD1、ENKD1、HP、ALPPL2、LOXHD1、PODNL1、LRIT2、CYP1A2、FUT6、MXI1、HYDIN和RNLS。其中HCN4、ACSBG1、ENKD1、HP和LOXHD1的突变为未报道过的新突变。
3.5 糖尿病相关基因：结合文献检索和KEGG通路分析，研究人员从16个候选基因中筛选出EPHX3和FHOD1与T2DM发生相关。EPHX3基因rs760409070位点突变可能通过抑制PIK3CB基因表达，下调磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路，导致葡萄糖转运蛋白4（Glucose transporter 4，GLUT4）的葡萄糖摄取与转运能力下降、糖原合酶激酶-3（GSK-3）促进糖原合成的作用减弱、叉头框转录因子O1（FOXO1）对糖异生的抑制作用降低，最终引起胰岛素抵抗、葡萄糖摄取受阻、糖原合成减少和糖异生增加，促进T2DM发生。FHOD1基因rs142023201位点突变导致其编码蛋白第498位天冬酰胺替换为丝氨酸，使FHOD1蛋白功能下降，通过与胰岛素调控的氨肽酶受体（Insulin-regulated aminopeptidase receptor，IRAP）的相互作用下调GLUT4的葡萄糖转运能力，进而升高血糖。
3.6 候选变异的计算机功能预测与数据库注释：针对两个候选错义变异进行多工具预测。EPHX3 p.Glu260Lys的SIFT（0.03）和CADD（24.7）预测为有害，PolyPhen-2（0.503）预测为可能有害，REVEL（0.178）预测为中性；FHOD1 p.Asn498Ser的SIFT（0.5）、PolyPhen-2（0）、CADD（9.086）和REVEL（0.061）均预测为良性或耐受。gnomAD v4.1.1数据库中，EPHX3变异在东亚人群中的等位基因频率为0/44,890，全球频率为1.18 × 10
-5；FHOD1变异在东亚人群中的频率为0/44,878，全球频率为1.92 × 10
-5。ClinVar将EPHX3变异分类为意义不确定，FHOD1变异分类为可能良性；GWAS Catalog均无相关记录。公共数据库注释结果支持这两个变异的稀有性和未被认识的特征。
讨论部分指出，EPHX3基因位于19p13.12，编码环氧化物水解酶3，其突变可能通过影响PIK3CB基因表达抑制PI3K/AKT通路，从而干扰胰岛素信号转导和葡萄糖代谢。FHOD1蛋白属于甲精蛋白家族，是肌动蛋白结合蛋白，可与IRAP相互作用参与GLUT4囊泡转运；该基因突变可能破坏这一过程，导致葡萄糖摄取减少。既往研究主要报道EPHX3多态性与结肠癌、喉癌及头颈鳞状细胞癌相关，FHOD1多态性与肥厚型心肌病和白血病相关，均未涉及T2DM家系。本研究中两个变异在东亚人群缺失且无既往T2DM关联记录，提示其稀有性。研究局限性包括：单一家系结果需在更大规模和散发糖尿病患者中验证；环境因素（如饮食习惯、体力活动）和正常成员的BMI数据未评估；无法确定两个突变是独立致病、协同作用还是存在主效与修饰关系；多数患者缺乏胰岛素抵抗指数（Homeostatic Model Assessment for Insulin Resistance，HOMA-IR）和C肽数据，限制基因型-表型关联分析。尽管计算机预测对FHOD1变异呈阴性，但当前工具主要基于序列保守性，对依赖蛋白质互作的结构性蛋白可能不适用，故家族共分离证据仍具有重要意义。
结论：通过全外显子测序和生物信息学分析，研究人员发现EPHX3基因rs760409070 [c.778G>A（p.Glu260Lys）]和FHOD1基因rs142023201 [c.1493A>G（p.Asn498Ser）]突变可能是该家系T2DM的致病基因突变。这两个突变可能通过降低外周组织对胰岛素的敏感性、减少葡萄糖摄取、抑制糖原合成和促进糖异生，从而参与糖尿病的发生发展。
