《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Identifying modulators of the nicotinic acetylcholine receptor EAT-2 for the control of plant parasitic nematodes
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农药开发需评估多种因素，以建立有效性和安全性特征，从而实现选择性并减少负面环境影响。在此方面，研究人员提出，EAT-2作为一种门选择性烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR），具备作为靶标的品质，兼具良好有效性和潜在选择性。其依据是该受体在线虫咽部功能中的核心作用，包
农药开发需评估多种因素，以建立有效性和安全性特征，从而实现选择性并减少负面环境影响。在此方面，研究人员提出，EAT-2作为一种门选择性烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR），具备作为靶标的品质，兼具良好有效性和潜在选择性。其依据是该受体在线虫咽部功能中的核心作用，包括对植物寄生线虫（PPNs）生活史关键阶段重要的活动。本研究中，研究人员利用模式线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）启动了一项中等通量筛选，旨在鉴定通过EAT-2抑制咽部功能的化学物质。体内筛选从192种化合物中鉴定出6种潜在EAT-2调节剂。这些化合物分别来自异黄酮类（isoflavonoids）、氨基乙腈衍生物（aminoacetonitrile derivatives）和氮杂双环庚烷（azabicyclo-heptane）化学类别，代表化合物分别为rotenone、monepantel类似物和epibatidine类似物。为更好界定其作用模式，研究人员在非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞中，针对与必需亚基EAT-18共表达的重组EAT-2，在体外测试了每组各一种化合物。这些化合物在重组受体上显示出微摩尔级拮抗剂效力。重要的是，它们抑制植物寄生线虫Globodera rostochiensis的口针推出（stylet thrusting）行为，显示其破坏寄生生活史的潜力。所鉴定的先导化合物对烟碱型乙酰胆碱受体亚型具有广泛作用模式。然而，所用筛选方法和所鉴定化合物验证了可精炼EAT-2效力、开发EAT-2药理学以获得更好杀线虫潜力的途径。
研究背景：植物寄生线虫（PPNs）严重威胁全球粮食安全，估计每年造成1730亿美元经济损失。传统化学杀线虫剂虽能通过干扰生活史关键环节控制线虫，但因环境持久性、抗药性和非靶标效应等，正受到日益严格的监管或禁用，因此亟需更安全、选择性更高的化学杀线虫剂。大多数农药为神经毒素，通过干扰离子通道、酶或神经元产生神经毒性；神经元信号在动物间高度保守，使药物选择性面临挑战。烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR，配体门控离子通道）因多样性、广泛表达和快速作用成为成熟靶标；levamisole和monepantel等胆碱能驱虫药已实现一定靶标选择性。EAT-2是一种门选择性nAChR，在线虫咽部功能中起核心作用，并与植物寄生线虫生活史关键阶段相关；研究人员据此提出EAT-2可作为兼具有效性和潜在选择性的靶标，并利用秀丽隐杆线虫（C. elegans，模式线虫）咽部泵动（pharyngeal pumping，咽肌收缩与舒张驱动摄食）表型筛选其调节剂。植物寄生线虫的口针推出（stylet thrusting，口针伸缩行为）对孵化、侵染和取食重要，因此EAT-2调节剂可能干扰寄生生活史。为此，研究人员开展了体内筛选、重组受体电生理验证和植物寄生线虫行为测试，以鉴定EAT-2调节剂并评估其杀线虫潜力；该研究为EAT-2药理学和新型杀线虫先导化合物提供了平台。
关键技术方法：以C. elegans lev-1(x427)突变体在24孔板中于30 μM测试192种化合物，同步评分咽泵、运动、后代、细菌生长和趋避；对命中物进行剂量-时间反应和体长测定。用5-羟色胺（5-HT）诱导Globodera rostochiensis感染性幼虫（J2s）口针推出并测试化合物。将EAT-2与EAT-18共表达于Xenopus laevis卵母细胞，以双电极电压钳（TEVC）记录乙酰胆碱（ACh）电流及拮抗作用。线虫株来自Caenorhabditis Genetic Centre（University of Minnesota）；G. rostochiensis胞囊来自James Hutton Research Institute（Scotland，由Vivian C. Blok提供）；马铃薯根渗出液（PRD）来自Catherine Lilley（University of Leeds）；化合物由Syngenta（UK）提供；卵母细胞购自European Xenopus Resource Centre（University of Portsmouth，UK）。
研究结果：3.1 筛选化合物的表型读出（Phenotypic readout of the effects of screened compounds）：研究人员用C. elegans lev-1(x427)突变体进行体内筛选，以nicotine（尼古丁）为阳性对照，192种化合物中12种抑制咽部泵动，6种诱导痉挛性麻痹而抑制运动，18种抑制产卵或孵化，4种抑制细菌菌苔形成，8种产生趋避效应；初筛确认了可作用于咽部功能的候选物。3.2 命中化合物对C. elegans咽部泵动的时间与剂量依赖性（Time and dose dependence of hit compounds on pharyngeal pumping on C. elegans）：12种咽泵抑制剂中6种复现，编码为AA2、AA4、BB2、CC2、CC12和H12，分别对应monepantel（胆碱能驱虫药）类似物（H12、AA2、BB2、CC2）、epibatidine（氮杂双环庚烷生物碱）类似物（AA4）和rotenone（异黄酮类化合物，CC12）。在野生型N2、lev-1(x427)和eat-2(ad468)突变体中，这些化合物在24 h内持续抑制咽泵；eat-2突变体本已咽泵降低，仍进一步下降，提示其作用并非EAT-2特异。3.3 命中化合物对C. elegans运动的影响（Effect of hit compounds on C. elegans motility）：6种抑制咽泵的化合物均诱导体壁肌痉挛性麻痹，处理组体长显著短于对照，表明其同时影响体壁肌功能。3.4 在Xenopus laevis中表征命中化合物（Characterizing hit compounds in Xenopus laevis）：EAT-2与EAT-18共表达于卵母细胞后，ACh诱发大电流，未注射或单亚基注射卵母细胞对100 μM ACh无反应；10 μM mecamylamine（美加明，nAChR拮抗剂）完全阻断100 μM ACh电流。30 μM命中物自身不诱发电流，但共应用时分别抑制ACh电流：monepantel类似物（AA2）30.8%、epibatidine类似物63.7%、rotenone 49.6%，表明其为EAT-2拮抗剂。3.5 在植物寄生线虫中考察命中化合物（Investigating hit compounds on plant parasitic nematodes (PPNs)）；3.5.1 命中化合物抑制G. rostochiensis口针推出（Hit compounds inhibit stylet thrusting in G. rostochiensis）：新鲜孵化的G. rostochiensis J2经30 μM化合物孵育24 h后，5-HT诱导的口针推出被显著抑制；rotenone强于monepantel类似物，epibatidine类似物最弱，mecamylamine亦强效；化合物均未致死线虫，提示可干扰寄生生活史行为。
讨论部分总结：研究人员认为EAT-2因其独特结构、功能及有限药理学特征而具选择性药效团潜力。筛选192种基于化学结构和已知作用模式选择的化合物，鉴定出氨基乙腈衍生物（aminoacetonitrile derivatives）、氮杂双环庚烷（azabicyclo-heptane）和异黄酮类（isoflavonoids）中具整体生物效应的EAT-2调节剂。monepantel类似物可诱导C. elegans体壁肌痉挛性麻痹并抑制咽行为，且对G. rostochiensis咽功能有抑制作用，提示其作用模式可能在 nematode species间保守；该麻痹说明药物作用非EAT-2特异，但体外电生理提示其可阻断受体，可能通过EAT-2及体壁肌间抑制性通讯共同抑制咽功能。epibatidine类似物为EAT-2拮抗剂，而epibatidine已知为nAChR高亲和激动剂；结构取代可改变活性/模式，较大N-连接取代可导致激动活性丧失甚至部分激动转拮抗。rotenone为天然异黄酮类杀虫剂，主要抑制呼吸链复合体I；其电生理抑制可能EAT-2依赖但不具选择性，且因卵母细胞呼吸链复合体I表达受抑，不能完全排除其呼吸作用影响卵母细胞反应。总体而言，该筛选平台成功鉴定咽功能调节剂并验证EAT-2拮抗剂，且显示其抑制G. rostochiensis口针推出；口针推出是否直接依赖EAT-2尚待确定，需进一步开展植物线虫侵染、根部定殖和发育试验以评估转化潜力。研究结论翻译：总之，研究人员利用基于C. elegans突变体表型的筛选平台并偏向筛选，成功鉴定出咽功能调节剂；筛选鉴定rotenone、monepantel类似物和epibatidine类似物为咽泵抑制剂，并验证其为靶受体EAT-2拮抗剂；最后显示这些化合物抑制G. rostochiensis口针推出功能。其是否直接源于EAT-2依赖性口针推出尚待确定。除此外，了解这些命中化合物在植物线虫侵染试验中的表现将更完整呈现其线虫控制潜力；线虫根部侵染、定殖和发育试验为推荐的转化步骤。然而，研究结果增加了EAT-2受体药理学，重要的是这些配体的鉴定为将EAT-2解析为具选择性杀线虫靶标潜力的药效团提供了平台。
