AI驱动发现雷公藤红素共价修饰SMAD3以调控糖尿病肾病纤维化的新机制

《Pharmacological Research》：AI-Guided Identification of a Covalent SMAD3 Regulatory Mechanism of Celastrol in Diabetic Kidney Disease

　　

人工智能（AI）与化学蛋白质组学鉴定雷公藤红素（Celastrol）为SMAD3的共价配体。雷公藤红素共价修饰未磷酸化形式SMAD3的Cys421。雷公藤红素促进KPNB1介导的未磷酸化SMAD3核转位。核内雷公藤红素在空间上破坏关键的SMAD3-SMAD4相互作用。靶向失活态SMAD3代表一种此前未被认识的抗纤维化策略。 研究人员采用预训练模型Uni-Mol并整合DKD特异性纤维化信号通路，开发面向DKD纤维化进展的预测模型，从天然产物库虚拟筛选得到雷公藤红素。体外与体内结果表明雷公藤红素具有强效抗纤维化活性。利用化学蛋白质组学与定点突变，研究人员确定SMAD3为雷公藤红素的直接相关共价靶点。雷公藤红素破坏SMAD3的核质穿梭，从而抑制其活化及下游转化生长因子-β（TGF-β）/SMAD信号通路，最终减轻肾小管上皮细胞中纤维化进展。据研究人员所知，这是首项将SMAD3表征为雷公藤红素可成药共价靶点的研究，为DKD相关纤维化治疗提供了新机制基础与有前景的治疗先导物。

研究背景方面，糖尿病肾病（Diabetic Kidney Disease，DKD）是终末期肾病（End-Stage Renal Disease，ESRD）的主要病因，病理上以肾小球基底膜增厚、系膜扩张、足细胞丢失及肾小管间质纤维化为核心驱动因素。目前虽可控制血糖与血压，但缺乏获批的特异性抗纤维化疗法。肾小管上皮细胞（Renal Tubular Epithelial Cells，RTECs）在高糖或炎症刺激下可发生上皮-间充质转化（Epithelial-to-Mesenchymal Transition，EMT），异常分泌纤连蛋白（Fibronectin，FN）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和胶原等细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）。TGF-β/SMAD信号是纤维化主调控通路，但靶向该通路的药物常因脱靶毒性和机制相关不良反应难以临床转化，如吡非尼酮（Pirfenidone，PFD）存在肝酶升高和胃肠不适。天然产物是重要药源，但传统筛选效率低。因此，研究人员用AI模型从天然产物中快速识别抗DKD纤维化先导物，并机制上验证其靶点价值。该论文发表于《Pharmacological Research》。

主要关键技术方法包括：基于Uni-Mol的机器学习虚拟筛选，使用ChEMBL生物活性数据微调模型并从天然产物库预测多通路抑制剂；化学蛋白质组学中的活性基蛋白质分析（Activity-Based Protein Profiling，ABPP），以碘乙酰胺探针竞争鉴定半胱氨酸共价靶点；表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）、药物亲和响应靶标稳定性（Drug Affinity Responsive Target Stability，DARTS）和细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）验证靶标结合与稳定性；RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）分析高糖刺激RTECs的转录组变化；分子动力学（Molecular Dynamics，MD）模拟解析SMAD3与SMAD4、KPNB1的界面动态；体内采用高脂饮食联合链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导的雄性C57BL/6小鼠2型DKD队列进行药效与毒性评价；遗传学功能实验采用SMAD3过表达与shRNA敲低细胞模型。

研究结果如下。2.1 AI驱动鉴定雷公藤红素为DKD强效抗纤维化候选物：研究人员整合4805个DKD基因与Uni-Mol模型，测试集平均AUC 0.9956，从天然产物库优选候选，雷公藤红素在100 nM显著下调高糖诱导FN，被选为后续对象。2.2 雷公藤红素减轻STZ诱导DKD小鼠肾功能障碍与纤维化损伤：HFD-STZ雄鼠经0.5与1.0 mg/kg腹腔给药，肾间质胶原沉积、α-SMA与FN上调、尿蛋白、肌酐和尿素氮均剂量依赖性改善，主要脏器未见明显毒性。2.3 雷公藤红素具有优效广谱抗纤维化效力：体内外均下调FN、胶原III与α-SMA；对TGF-β1、CCN2、Angiotensin II诱导纤维化也有效；50 nM效果优于10 μM依那普利或恩格列净，较500 μM吡非尼酮低万倍浓度即相当。2.4 雷公藤红素通过调控SMAD3磷酸化抑制TGF-β/SMAD3信号：RNA-seq显示差异基因富集TGF-β信号；雷公藤红素降低p-SMAD3，TGF-β激动剂TMAO与SRI-011381可逆转其抗纤维化作用，证明依赖TGF-β抑制。2.5 化学蛋白质组学鉴定SMAD3为雷公藤红素直接共价靶点：ABPP鉴定1616个探针竞争蛋白，与DKD基因交叉得398个，SMAD蛋白信号转导类别富集SMAD3、MAPK8、RBPMS、PML。2.6 雷公藤红素结合SMAD3 Cys421发挥抗纤维化作用：SPR得K_D 6.25 μM；DARTS与CETSA证稳定化；对接与丙氨酸突变表明Cys421为关键位点，Cys421突变使药物失效、p-SMAD3不被抑制、CAGA12荧光素酶转录活性不被抑。2.7 雷公藤红素诱导未磷酸化SMAD3提前核输入并阻碍SMAD4复合体组装：Co-IP示SMAD3-SMAD4与SMAD3-TGFBR1结合减弱，SMAD3-KPNB1增强；核质分离与免疫荧光见总SMAD3核聚集而核内p-SMAD3减少；MD显示SMAD3-cela/SMAD4界面接触与氢键下降、溶剂可及表面积（Solvent-Accessible Surface Area，SASA）上升，SMAD3-cela/KPNB1则界面稳定、氢键维持，促进非磷酸化SMAD3经KPNB1入核而避开通路磷酸化。2.8 雷公藤红素以SMAD3依赖方式减轻肾纤维化：SMAD3过表达削弱药效，shRNA敲低增强药效，在高糖与TGF-β条件下一致。

讨论部分总结：研究人员指出AI加化学蛋白质组学可拓展至IgA肾病与局灶节段性肾小球硬化等药物发现。雷公藤红素源自雷公藤，既往多报道肝心皮抗纤维化，本研究发现其DKD肾小管抗纤维化新靶点。研究局限包括无雷公藤红素化学探针、LC–MS/MS位点直接制图未 conclusive、仅用雄性小鼠未评估性别差异。雷公藤红素多靶点特性意味着SMAD3并非唯一介导蛋白，PKM2等也可能参与。临床转化受水溶性差、口服生物利用度低（约17.06%）、治疗窗窄限制，纳米递送或可改善。

研究结论部分翻译：研究人员采用基于Uni-Mol模型的机器学习策略，鉴定天然产物雷公藤红素为对抗DKD的强效抗纤维化剂，疗效优于标准疗法。活性基蛋白质分析揭示雷公藤红素直接共价结合SMAD3于Cys421。该结合可能诱导拟磷酸化构象变化，破坏SMAD3与TGFBR1及SMAD4的相互作用，促进失活态SMAD3核输入，抑制促纤维化转录。Cys421突变消除雷公藤红素药效，确立SMAD3为关键功能靶点。本工作将雷公藤红素确定为DKD大有前景的治疗候选物，并验证通过靶向SMAD3治疗纤维化的新策略。