《Pharmacological Research》：Pharmacological TRPM8 blockade reprograms patient-derived intestinal fibroblasts and mitigates experimental fibrosis through modulation of myofibroblast activation
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瞬时受体电位melastatin-8（TRPM8）在狭窄性克罗恩病（CD）成纤维细胞中表达上调；AMTB抑制患者来源肠道成纤维细胞的活化；TRPM8阻断减弱三硝基苯磺酸（TNBS）相关的纤维化重塑；TRPM8激动剂WS12不能重现TRPM8阻断的保护效应；AM
瞬时受体电位melastatin-8（TRPM8）在狭窄性克罗恩病（CD）成纤维细胞中表达上调；AMTB抑制患者来源肠道成纤维细胞的活化；TRPM8阻断减弱三硝基苯磺酸（TNBS）相关的纤维化重塑；TRPM8激动剂WS12不能重现TRPM8阻断的保护效应；AMTB在离体（ex vivo）条件下印迹一种活化程度较低的成纤维细胞表型。肠道纤维化是炎症性肠病（IBD）常见的长期并发症，在克罗恩病中最为普遍，其特征是细胞外基质（ECM）过度沉积和组织重塑，逐渐导致肠壁僵硬、狭窄、梗阻以及需要重复内镜或手术干预。尽管在控制炎症方面取得了重大进展，肠道纤维化仍是IBD中最大的未满足需求之一，目前尚无获批的抗纤维化疗法。纤维化的发展是一个多步骤且异质性的过程，受遗传易感性、持续免疫失调、环境和微生物因素、上皮损伤以及组织驻留基质程序的持久激活影响。从机制角度看，肠道纤维化不仅由ECM积累维持，还由基质细胞（尤其是成纤维细胞和肌成纤维细胞）的持续激活，以及加剧重塑的适应不良性上皮和免疫信号网络所维持。在可溶性介质中，转化生长因子-β（TGF-β）是协调胶原生成和肌成纤维细胞活化的关键促纤维化因子，而上皮可塑性程序（通常称为类上皮-间质转化转录变化）与慢性损伤和重塑相关。同时，IL-23/Th17轴等免疫回路与慢性肠道炎症和组织重塑密切相关，提供了黏膜免疫激活与纤维化进展之间的机制联系。 collectively, 这些观察结果表明，针对狭窄性CD的有效抗纤维化策略应优先靶向可药理学干预的上游节点，这些节点协调基质活化与上皮和免疫来源的促纤维化信号，而非仅关注晚期ECM积累。瞬时受体电位（TRP）通道已成为微环境应激的多模式细胞传感器，将化学、机械和热线索转化为调节炎症、屏障功能和细胞活化程序的离子信号。在该家族中，冷敏感和薄荷醇敏感通道TRP melastatin-8（TRPM8）因其在感觉神经元之外的表达而日益受到关注，并已涉及免疫调节过程，影响外周组织中细胞因子驱动的炎症反应以及炎症环境中的组织反应，包括实验性肠道炎症。值得注意的是，现有证据表明TRPM8在肠道炎症中的作用具有情境依赖性：虽然早期研究报道了TRPM8激活在结肠炎模型中的保护作用，但最近的研究表明，TRPM8基因缺陷或用木犀草素进行TRPM8阻断可通过重塑先天免疫应答和巨噬细胞免疫代谢来降低实验性结肠炎严重程度。然而，尽管TRPM8生物学在炎症背景下被越来越多地讨论，但其在肠道纤维化发生中的参与，以及TRPM8调节对基质效应功能（成纤维细胞增殖、迁移和胶原生成活化）的药理学后果，仍未得到充分定义。在本研究中，研究人员通过聚焦TRPM8拮抗作为CD相关纤维化的候选抗纤维化药理学策略来解决这一空白。研究人员使用来自CD患者的配对狭窄和非狭窄回结肠组织来评估人纤维化微环境以及原代患者来源肠道成纤维细胞中的TRPM8表达。接下来，研究人员使用AMTB（一种广泛使用的TRPM8拮抗剂）研究了原代人CD来源炎症性成纤维细胞中TRPM8药理学阻断的功能后果。然后，研究人员通过在肠道纤维化的三硝基苯磺酸（TNBS）模型中测试AMTB，并对从AMTB处理的纤维化小鼠中分离的成纤维细胞进行分析，以确定体内TRPM8拮抗是否与离体成纤维细胞活化的持续减弱相关，从而评估了TRPM8拮抗的体内相关性。为了补充基于拮抗剂的方法并对TRPM8进行更广泛的药理学探究，研究人员还在患者来源的肠道成纤维细胞和TNBS模型中评估了选择性TRPM8激动剂WS12。总体而言，该研究旨在（i）确定TRPM8是否与人狭窄性CD微环境相关，（ii）确定TRPM8药理学阻断是否抑制CD来源成纤维细胞中的促纤维化行为和活化标志物，以及（iii）测试TRPM8拮抗是否能减轻TNBS驱动的肠道重塑的临床、内镜、组织学和分子特征，并（iv）使成纤维细胞在离体条件下表现出活化减弱以及胶原生成和收缩特征降低的表型。通过将患者来源证据与离体和体内药理学相结合，研究人员提供了一个转化框架，支持TRPM8拮抗作为一种限制成纤维细胞活化和狭窄性克罗恩病肠道纤维化重塑的药理学方法。
**论文解读：TRPM8阻断通过调控肌成纤维细胞活化重塑肠道纤维化微环境**
**一、研究背景与科学问题**
肠道纤维化是炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）最常见的长期并发症，在克罗恩病（Crohn's disease, CD）中尤为突出。其病理特征为细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积与组织重塑，最终导致肠壁僵硬、狭窄形成、肠梗阻，患者常需反复接受内镜或外科干预。尽管抗炎治疗已取得显著进展，但目前仍无获批上市的抗纤维化药物，肠道纤维化因此成为IBD领域最大的未满足临床需求之一。从发病机制来看，肠道纤维化并非单纯的ECM堆积，而是由持续活化的基质细胞（尤其是成纤维细胞和肌成纤维细胞）与上皮、免疫来源的促纤维化信号网络相互强化所驱动的动态过程。转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）是驱动胶原生成和肌成纤维细胞活化的核心促纤维化因子；IL-23/Th17免疫轴亦深度参与慢性肠道炎症与组织重塑。因此，理想的抗纤维化策略应优先靶向可药理学干预的上游调控节点，以协调基质活化与上皮、免疫来源的促纤维化信号，而非仅针对晚期ECM沉积。
瞬时受体电位（transient receptor potential, TRP）通道家族是多模式细胞传感器，能将化学、机械及热刺激转化为调节炎症、屏障功能和细胞活化程序的离子信号。其中，冷敏感和薄荷醇敏感通道TRP melastatin-8 (TRPM8) 除感觉神经元外在多种外周组织中亦有表达，并参与免疫调节和组织炎症反应。然而，TRPM8在肠道炎症中的作用具有明显的情境依赖性：早期研究报道TRPM8激活在结肠炎模型中具有保护作用，而近期研究则表明TRPM8基因缺陷或药理学阻断可减轻实验性结肠炎。更重要的是，TRPM8是否参与肠道纤维化发生，以及其药理学调节对成纤维细胞增殖、迁移和胶原生成活化等基质效应功能的影响，此前尚缺乏系统研究。基于此，本研究旨在探讨TRPM8拮抗作为CD相关纤维化的候选抗纤维化策略，综合运用患者组织标本、原代细胞培养、体内药理学模型及离体功能分析，评估TRPM8阻断对肠道纤维化进程中成纤维细胞活化的调控作用。
**二、主要技术方法**
研究人员采用了多层次的实验体系。首先，收集CD患者因纤维狭窄并发症接受回结肠切除术的配对狭窄及非狭窄回结肠组织（伦理批准号252），通过羟脯氨酸测定和RT-qPCR确认纤维化特征。其次，从手术标本中新鲜分离原代人肠道成纤维细胞，用于药物处理实验。体内研究采用三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS）诱导的小鼠肠道纤维化模型（C57BL/6J雌性小鼠，意大利卫生部批准号610/2024-PR），分别给予TRPM8拮抗剂AMTB（10 mg/kg，腹腔注射）和TRPM8激动剂WS12（10 mg/kg，腹腔注射），每周三次，持续至安乐死。研究还结合了疾病活动指数（DAI）评估、高分辨率迷你内镜评分（MEICS）、组织学染色（H&E、Masson三色、天狼星红及偏振光分析）、流式细胞术检测固有层单核吞噬细胞和Th17细胞、原代小鼠结肠成纤维细胞分离培养及定量RT-PCR基因表达谱分析。
**三、研究结果**
**3.1 TRPM8在狭窄性CD组织和患者来源成纤维细胞中上调，其药理学阻断抑制促纤维化成纤维细胞特征**
对CD患者配对组织分析显示，狭窄区TRPM8表达显著高于非狭窄区。从狭窄CD组织分离的原代成纤维细胞同样表现出TRPM8显著上调，并呈现活化/促纤维化表型（α-SMA、vimentin、FAP、Col1a1、PDGFR-α表达增加）。AMTB以浓度依赖性方式抑制成纤维细胞增殖（3 μM和10 μM达统计学显著），10 μM显著降低细胞迁移能力，并下调上述活化标志物表达；TRPM8激动剂WS12对细胞活力和增殖无显著影响。
**3.2 TRPM8药理学拮抗（而非激动）在体内减弱TNBS相关疾病活动和基质重塑**
TNBS模型小鼠表现出DAI评分和MEICS内镜评分的显著升高，以及结肠α-SMA和Col3a1表达增加。AMTB处理显著降低DAI、MEICS评分以及α-SMA、vimentin和Col3a1的表达；WS12对这些参数均无显著改善作用。
**3.3 TRPM8药理学阻断减轻TNBS小鼠的组织学损伤和胶原纤维重塑**
组织学分析显示，TNBS诱导明显的黏膜下和肌层增厚、隐窝扩大及炎症评分升高，AMTB处理部分保留了组织结构的完整性，显著降低炎症评分和Masson三色染色阳性面积。偏振光分析显示AMTB显著减少TNBS诱导的红橙色双折射胶原纤维面积，表明其对纤维胶原基质组织结构具有保护作用。
**3.4 AMTB减少Th17反应而不改变CX3CR1?单核吞噬细胞的IL-23产生**
流式细胞术分析显示，AMTB对CX3CR1int和CX3CR1hi单核吞噬细胞亚群中IL-23?细胞比例无显著影响，但显著降低了CD4?T细胞区室中IL-17?（Th17）细胞的比例，提示其免疫调节作用并非通过直接抑制巨噬细胞来源IL-23实现，而可能涉及对Th17反应的下游调控。
**3.5 体内TRPM8阻断在离体条件下印迹活化程度较低的成纤维细胞表型**
从TNBS+AMTB小鼠分离的原代结肠成纤维细胞在体外扩增后表现出细胞数量显著减少，α-SMA、Col1a1、Col3a1、Tagln、Fap和Cnn1等活化/收缩标志物表达明显降低，肌动蛋白细胞骨架重塑减弱（phalloidin荧光强度降低），表明体内TRPM8拮抗可在离体条件下保留的成纤维细胞活化减弱表型。
**四、讨论与结论**
本研究揭示了TRPM8在狭窄性CD微环境中的上调及其与成纤维细胞活化的功能关联。AMTB在患者来源成纤维细胞中直接抑制增殖、迁移及活化标志物，并在体内模型中减轻纤维化重塑；而WS12未重现这些效应，进一步强化了TRPM8阻断的药理学合理性。研究结果表明，TRPM8拮抗对纤维化的影响涉及对成纤维细胞活化程序的直接调控，同时也伴有Th17反应的减少，但其免疫调节作用并非主要通过抑制CX3CR1?巨噬细胞IL-23产生实现。离体成纤维细胞表型分析支持AMTB在组织微环境中调节成纤维细胞活化并留下持久印记的观点。研究结论指出，TRPM8是狭窄性CD微环境中一个可药理学靶向的通道，与肠道成纤维细胞活化功能相关；AMTB可抑制患者来源成纤维细胞的促纤维化行为并减轻TNBS诱导的肠道纤维化，分离自治疗小鼠的成纤维细胞保留活化减弱的胶原生成/收缩表型，为TRPM8阻断治疗狭窄性克罗恩病和肠道纤维化重塑提供了转化医学依据。
