ERG协调前列腺癌中的去分化–衰老–炎症三联征

《Molecular Cancer Research》：ERG Orchestrates a Dedifferentiation–Senescence–Inflammation Triad in Prostate Cancer

　　

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摘要

ERG融合事件发生在约50%的前列腺癌中，代表与肿瘤发生共同起始的早期体细胞事件。然而，ERG在疾病起始时所启动的分子程序仍不清楚。在本研究中，可诱导的、时间可控的ERG表达使我们能够准确绘制与ERG驱动相关且与细胞适应性表观降低相关的早期ERG驱动过程，研究涵盖一系列前列腺细胞。我们观察到ERG触发衰老和上皮-间充质转化（EMT），产生不同的细胞状态，其中EMT和衰老可在同一细胞中共存或独立发生。ERG介导的经典和非经典TGFβ信号通路的激活差异性调控EMT和衰老标志物。此外，ERG驱动细胞身份的依赖性变化，并促进具有干细胞基因表达的中间基底-腔内细胞群体。值得注意的是，p53缺失增强了ERG驱动的细胞可塑性标志物的表达，但不影响衰老。对ERG表达的腺上皮细胞的转录组研究揭示了炎症信号的激活。条件性培养基实验证明在ERG阴性的腺上皮细胞、基质细胞和髓系细胞中存在旁分泌介导的炎症。与此一致，来自五个独立队列和2,048名患者的患者来源表达数据显示，在ERG重排肿瘤中TNFA-NFKB和TGFβ信号通路被激活。此外，去卷积分析表明ERG阳性肿瘤中炎症性巨噬细胞浸润程度更高。总之，我们揭示了一个此前未被认知的ERG驱动过程三联体——去分化、衰老和炎症——它们可能是ERG致癌潜力的基础，并塑造前列腺癌的发生和治疗反应。

意义：前列腺细胞中ERG表达的时间可控性使我们能够准确绘制ERG驱动的过程，确定去分化、衰老和炎症是ERG依赖性肿瘤发生和治疗反应的候选贡献因素。

图形摘要

简介

涉及ETS家族转录因子的基因组重排是前列腺癌中最常见的异常（1）。在局限性前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌（CRPC——疾病的一种晚期且致命的阶段）中，雄激素受体（AR）调控基因（主要是TMPRSS2）的调控区与ETS成员ERG的融合（以下简称T2ERG）在40%至50%的病例中驱动ERG蛋白的异常表达（2，3）。ERG融合在癌前前列腺上皮内瘤变（PIN）中可被检测到，并被认为是前列腺癌肿瘤发生的一个早期事件（4–6）。相应地，体内研究表明，当ERG与其他突变（如PTEN缺失或AKT激活）结合时，或在高水平表达时，ERG在前列腺癌起始中具有因果关系（7–12）。此外，基于T2ERG阳性CRPC模型的研究强调了ERG在该情境中的相关性（13–15）。尽管ERG的致癌潜力已明确（7，9，10，12，14），但ERG如何促进前列腺癌的发生和发展仍不清楚，这限制了ERG相关的转化潜力。原发性前列腺癌通常以细胞可塑性丧失为特征，表现为腔内细胞区室扩张和基底上皮细胞的随后丢失（16）。相应地，多项研究报告了ERG在促进AR信号传导和前列腺癌细胞腔内谱系中的作用（9，16–22）。例如，ERG在PTEN缺失模型中恢复了AR转录输出的表达，并通过抑制远端增强子抑制TP63的表达，后者是基底前列腺谱系的已知调控因子（9，20）。此外，ERG过表达和ERG通路激活是前列腺癌患者样本中腔内特征的标志（21，22）。与这些发现相反，功能研究表明ERG通过诱导上皮-间充质转化（EMT）（参考文献23–25）破坏前列腺癌的谱系特异性分化，并在体外和体内模型中阻断了腔内细胞和神经内分泌（NE）细胞分化（26）。此外，ERG通过促进PRMT5依赖的AR甲基化以及诱导由H3K27甲基转移酶EZH2和多种组蛋白去乙酰化酶介导的抑制性表观遗传程序来抑制AR及其信号传导（13，27）。鉴于这些关于ERG致癌活性的相互矛盾的观察结果，在本研究中，我们使用可诱导的、时间可控的系统在多种前列腺细胞系中比较T2ERG表达的转录和生物学效应。我们确定了去分化的诱导、衰老和炎症是ERG致癌工具箱中的关键要素，揭示了ERG诱导的塑造前列腺癌肿瘤发生和治疗反应的新型特征。

材料与方法

细胞培养、转染和转导

22Rv1（RRID: CVCL_1045）、LNCaP-FGC（RRID: CVCL_1379）和THP-1（RRID: CVCL_0006）在补充有10%胎牛血清（FBS；Gibco）、1% L-谷氨酰胺（Gibco）和1%青霉素-链霉素（Gibco）的RPMI 1640培养基（Gibco）中培养。DU145（RRID: CVCL_0105）和HEK293T（RRID: CVCL_0063）在补充有10% FBS、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基（Gibco）中培养。RWPE-1（RRID: CVCL_3791）在补充有5 ng/mL人重组表皮生长因子（Gibco）、0.05 mg/mL牛垂体提取物（Gibco）和1%青霉素-链霉素的角质细胞无血清培养基（Gibco）中培养。细胞系购自美国模式培养物收藏中心（ATCC）、欧洲认证细胞培养物收藏中心，和/或通过ATCC短串联重复序列图谱进行认证。所有细胞系常规检测且支原体阴性。人原代前列腺成纤维细胞购自Cell Biologics（H-6223），在完全成纤维细胞培养基（M2267，Cell Biologics）中培养。对于多西环素（DOX）诱导的过表达，将目的基因克隆入pCW57.1（#41393，Addgene，RRID: Addgene_41393）。对于ERG敲低，短发夹RNA（shRNA；补充表S8）克隆入pLKO.1-TRC（#10878，Addgene，RRID: Addgene_10878）。对于PTEN沉默，shRNA（补充表S8）克隆入Tet-pLKO-puro（#21915，Addgene，RRID: Addgene_21915）。对于TP53、CDKN2B和CDKN1C的敲除（KO），单导向RNA（sgRNA；补充表S8；参考文献28）克隆入优化的lentiCRISPR-V1（29）或lentiCRISPR-V2（#52961，Addgene，RRID: Addgene_52961）。使用插入/缺失分解追踪法（30）评估基因组编辑效率。对于慢病毒载体生产，使用聚乙烯亚胺（408727 Sigma-Aldrich）将编码目的基因、sgRNA或shRNA的10 μg质粒、6.5 μg psPAX2（#12260，Addgene，RRID: Addgene_12260）和3.5 μg pCMV-VSV-G（#8454，Addgene，RRID: Addgene_8454）转染至HEK293T细胞。在转染后48和72小时收集含慢病毒载体的培养基，通过0.45-μm PES滤器过滤并混合。对于转导，将22Rv1、LNCaP和DU145与含8 μg/mL多聚精胺（sc-134220，Santa Cruz Biotechnology）的慢病毒上清液孵育24小时。RWPE-1在37°C下以1,000 g离心30分钟，与含8 μg/mL多聚精胺的慢病毒上清液共孵育。根据所用慢病毒载体，使用2 μg/mL嘌呤霉素（ant-pr-1，InvivoGen）、0.5 μg/μL潮霉素（ant-hg-2，InvivoGen）或0.5 μg/μL庆大霉素（G418硫酸盐，11811031，Gibco）筛选细胞。对于1 μg/mL DOX（14422，Cayman Chemical）诱导的转基因或shRNA以及药物抑制剂处理，每2天更换一次培养基。对于条件性培养基（CM）实验，细胞在全培养基中添加乙醇（EtOH）或DOX中诱导4天（第2天换液）。收集上清液，用0.22-μm滤器过滤后给予受体细胞，将三分之二的CM与三分之一的全培养基混合，并根据收集时培养皿中的细胞数量进行标准化。如果未立即使用，CM储存在-80°C。RWPE-1和成纤维细胞用CM处理4天（第2天换液）后检测衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-B-GAL）、波形蛋白（VIM）和基因表达变化。THP-1细胞用20 ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（10515491，Thermo Fisher Scientific）分化为M0巨噬细胞2天，然后用CM处理2天。

结晶紫染色和增殖实验

细胞以低密度铺板并按指示进行处理。对于LNCaP细胞，使用聚-L-赖氨酸（33225.01，Serva）溶液包被孔表面。对于结晶紫实验，细胞用4%甲醛溶液（252549，Sigma-Aldrich）固定10分钟，然后用0.1%结晶紫溶液（溶于20% EtOH）在室温下染色30分钟。对于增殖实验，使用Incucyte S3（Sartorius）对细胞成像并评估融合度来获取生长曲线，使用Incucyte Basic Analyzer软件包进行分析。

软琼脂实验

将0.7%琼脂糖（CSL-AG500，Cleaver Scientific）溶于完全培养基的溶液倒入每个孔中并凝固。总计15,000个细胞（六孔板格式）与完全培养基、0.35%琼脂和特定处理混合后放置在底层0.7%琼脂层上。上面加入含特定处理的完全培养基。细胞培养28天，每周换液两次。治疗结束后，细胞用0.1%结晶紫（溶于20% EtOH）溶液染色30分钟，并用1X PBS（Gibco）洗涤。每个孔拍摄五张中的四张图片，使用ImageJ软件（RRID: SCR_003070）进行分析。

SA-Β-GAL染色

使用SA-Β-GAL染色试剂盒（9860，Cell Signaling Technology）按照制造商说明鉴定SA-B-GAL阳性细胞。使用Leica DM IL LED显微镜（Leica Microsystems）对细胞成像，每个条件每孔四或五张图片，使用ImageJ软件（RRID: SCR_003070）定量SA-B-GAL阳性细胞的百分比。

流式细胞术分析

使用Click-iT Plus EdU流式细胞术检测试剂盒（C10635，Thermo Fisher Scientific）进行5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和碘化丙啶（PI）荧光激活细胞分选（FACS），并作如下修改。细胞用10 μmol/L EdU标记2小时，然后通过胰蛋白酶消化收获。之后，细胞在400 g下离心5分钟沉淀，用1× PBS洗涤。细胞在冰冷EtOH中固定并在-20°C过夜保存。按照制造商说明进行Click-iT反应。最后，将细胞重悬于含RNase A和PI的1X PBS中，在37°C孵育30分钟并进行分析。对于Annexin V/PI FACS，使用Accutase（A6964，Sigma-Aldrich）收获细胞并用1× PBS洗涤两次。将细胞（2 × 10?）与1× Annexin V结合缓冲液（BD Pharmingen）和5 μL APC-Annexin V（550474，BD Pharmingen，RRID: AB_2868885）在室温下避光孵育15分钟。之后加入400 μL 1X Annexin V结合缓冲液和5 μL PI，分析样品。对于抗体法FACS，通过胰蛋白酶消化收获细胞，重悬于1× PBS中，在冰冷EtOH中固定并在-20°C过夜保存。细胞用1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS洗涤，并在1% BSA-PBS中加入一抗在室温下孵育1小时。洗涤后，在1% BSA-PBS中加入二抗，在室温下避光孵育30分钟。FACS所用抗体列于补充表S8中。对于SA-B-GAL/VIM FACS，通过胰蛋白酶消化收获细胞，用1× PBS洗涤一次，在4%多聚甲醛（PFA，043368.9M，Thermo Fisher Scientific）-PBS中固定10分钟。细胞用1% BSA-PBS洗涤，并在B-GAL工作液（100 μL，CellEvent Senescence Green Flow Cytometry Assay Kit，C10840，Thermo Fisher Scientific）中于37°C孵育2小时。洗涤后，细胞用0.25% TritonX-100溶于1% BSA-PBS中在室温下通透30分钟，并按上述方法进行染色。所有FACS样品在FACSymphony A1细胞分析仪（BD Biosciences）上分析，并使用FlowJo软件（版本10.9.0，BD Biosciences，RRID: SCR_008520）定量。

免疫印迹

细胞用RIPA缓冲液（50 mmol/L HEPES pH 7.9，140 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1% Triton-X-100，0.1% 钠去氧胆酸盐和0.1% SDS）裂解，加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒液（535140，P5726和P0044，Merck）。使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒（23228，Thermo Fisher Scientific）测定蛋白浓度，每个样品加载等量总蛋白并在Bolt Bis-Tris Plus胶（Invitrogen）或Mini-PROTEAN TGX Stain-Free蛋白胶（Bio-Rad）上电泳，转移至Amersham Hybond聚偏氟乙烯Western印迹膜（Cytiva）。膜用5%脱脂奶粉或含0.1% Tween的BSA-TBS缓冲液封闭。免疫印迹所用的一抗和二抗列于补充表S8中。使用Amersham ECL Prime或Select试剂（Cytiva）在UVITec Alliance LD2系统上检测。

免疫组织化学和免疫荧光

如先前所述（31），对PIN和腺癌人类样本中的ERG和巨噬细胞标志物（CD68和CD163）进行免疫组织化学。抗体列于补充表S8中。样本按照圣基亚拉医院机构指南在伦理方案批准编号#1946下进行处理。对于免疫荧光，将细胞接种在PhenoPlate 96孔微孔板（6055302，Revvity）中并按指示进行处理。

# 方法

## 免疫荧光染色与共聚焦显微镜成像

细胞用4%多聚甲醛在室温下固定15分钟，然后用1×PBS洗涤后，以封闭液（含3% BSA和0.3% Triton X-100的PBS）处理40分钟。一抗在含1% BSA和0.3% Triton X-100的PBS中室温孵育1小时。洗涤后，将二抗（用封闭液稀释）加入细胞中，避光室温孵育1小时。细胞经1×PBS洗涤后，用10 μg/mL Hoechst染色10分钟。使用ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System（Molecular Devices）进行图像采集。

## RT-qPCR与定量染色质免疫沉淀

使用RNeasy mini试剂盒（74106，Qiagen）提取总细胞RNA，包括柱上DNase I消化（79256，Qiagen）。逆转录使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622，Thermo Fisher Scientific）进行，cDNA用补充表S8中列出的引物和KAPA SYBR FAST UNI（KK4602，Roche）在CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）上进行分析。结果以GAPDH表达量归一化。对于染色质免疫沉淀（ChIP），细胞用1%甲醛在室温下交联10分钟。细胞裂解缓冲液（5 mmol/L PIPES pH 8.0，85 mmol/L KCl，1% Igepal）提取后，细胞核用裂解缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl pH 8.1，10 mmol/L EDTA，1% SDS）重悬。裂解液经超声处理后，使平均DNA片段大小达到100至300 bp。染色质与抗体在4°C过夜孵育。使用Dynabeads（Thermo Fisher Scientific）回收染色质-抗体复合物。洗涤后，染色质经洗脱、解交联，并用RNase A和蛋白酶K处理。DNA使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit（740609250，MACHEREY-NAGEL）纯化，并用KAPA SYBR FAST UNI（KK4602，Roche）和CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）进行qPCR分析。

## RNA测序

使用RNeasy mini试剂盒（74106，Qiagen）提取总细胞RNA，包括柱上DNase I消化（79256，Qiagen），并使用Qubit RNA Broad-Range Assay Kit（Q10210，Thermo Fisher Scientific）定量。含有Poly-A的mRNA分离和文库制备使用TruSeq Stranded mRNA Library Prep（20020594，Illumina）和AMPure XP SPRI Reagent（A63881，Beckman Coulter）完成。文库定量使用Qubit dsDNA High-Sensitivity Assay Kit（Q32854，Thermo Fisher Scientific）。文库在HiSeq测序系统（Illumina）上使用HiSeq Rapid SR Kit v2（100循环，Illumina）进行测序。质控剪短使用trimmomatic（RRID: SCR_011848；参考文献32），比对到人类参考基因组hg38使用STAR（版本2.7.2b，RRID: SCR_004463；参考文献33）。差异基因表达分析使用edgeR包（RRID: SCR_012802；参考文献34）进行。基因集富集分析（GSEA；参考文献35、36）使用GSEAPreranked工具进行，采用来自MSigDB的C2和Hallmark集合（http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb）。选定的前列腺特异性基因集来源于之前的研究（37–41），并插入Hallmark集合中用于预排序GSEA分析。

## 患者来源数据集与转录组分析

Song队列（6个ERG阳性样本；参考文献42）和Apostolov队列（24个肿瘤样本；参考文献43）的前列腺癌单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分别以.rds和.h5ad文件格式下载。保留恶性上皮细胞用于下游分析。为确定Apostolov队列中的ERG状态，使用Seurat R包中的Louvain算法进行聚类分析。最佳分辨率（0.1–1）的选择标准为最大化PCA嵌入上计算的中位轮廓系数。ERG+细胞的定义为同时具有升高的ERG融合特征分数和ERG基因表达。定义参考聚类为具有最低中位ERG特征的聚类。仅当两项检验均显著（Benjamini–Hochberg校正的Wilcoxon秩和检验，FDR < 0.05）时，才认为聚类为ERG+富集，并使用相同标准进一步亚聚类。然后通过单侧二项式检验评估患者水平的ERG阳性状态，FDR < 0.05的患者被归类为ERG+。背景率（p），即零假设下预期的ERG+细胞比例（即随机出现ERG+细胞的概率），设为1%。为确认患者ERG+细胞百分比是否代表真正的生物信号而非背景噪声，该检验计算纯粹偶然观察到k个或更多ERG+细胞的概率：

P(X≥k) = Σ(i=k到n) C(n,i) × p^i × (1-p)^(n-i)

其中n为细胞总数，k为给定患者中ERG+细胞的数量。不同背景率（p = 1–50%）的敏感性分析表明，患者分类具有稳健性，在1%至6%的噪声阈值范围内保持稳定。总共24名患者中有8名被归类为ERG+。ERG+（n = 74）和ERG阴性（ERG?；n = 77）样本的基因表达数据从cBioPortal的Taylor数据集中获取（44、45）。TCGA前列腺腺癌（TCGA-PRAD）队列的Bulk RNA-seq数据使用recount3 R包（46）获取，并归一化为每百万计数（CPM）。通过TCGAbiolinks R包中的PanCancerAtlas_subtypes()函数（https://gdc.cancer.gov/content/tcgabiolinks）检索部分患者（n = 333）的ERG融合状态，获得152例ERG+和181例ERG?患者。对于有多次活检的患者，表达值取平均值。为将ERG分类扩展到未标注样本，我们使用pROC R包（47）结合Youden方法，对已知ERG融合状态的患者进行ROC分析，确定10.64 CPM为ERG阳性阈值，得到208例ERG+和297例ERG?肿瘤（n = 505），对应208例ERG+和293例ERG?患者（n = 501）。使用CIBERSORT（RRID: SCR_016955）和造血细胞特征矩阵（LM22；参考文献48）进行基于参考的免疫细胞反卷积，以估计细胞类型组成。R脚本从https://cibersortx.stanford.edu/下载，以默认参数运行。

### ARNEO临床试验（NCT03080116）转录组数据

Decipher前列腺基因组分类器检测，一种临床级别的转录组全范围阵列检测（Veracyte），在甲醛固定石蜡包埋的诊断核心活检样本（n = 89）上进行。72份活检样本通过质量控制，其中65份有匹配的ERG免疫组化染色以确定ERG状态。特征分数来自Decipher GRID（49）中包含的特征库，其中ERG特征分数与ERG免疫组化的AUC为0.96（补充图S5G）。使用R中的limma包（RRID: SCR_010943）对Hallmark特征分数进行差异分析（23例ERG+肿瘤和42例ERG?肿瘤）。该试验按照《赫尔辛基宣言》的原则进行，并经UZ/KU Leuven医学伦理委员会批准。所有参与者在任何研究相关操作前均提供书面知情同意。

### STAMPEDE（NCT00268476）转录组数据

肿瘤转录组全范围特征分数数据和ERG连续/分类特征分数如参考文献（49）所述。在活检时，1,325例ERG+和ERG?肿瘤的Hallmark特征分数根据诊断时的转移分期（转移期M0和非转移期M1）进行比较。差异通路分析使用R中的limma包进行。

## 统计分析

统计检验方法、重复次数、误差线定义及统计学显著性定义见各图注中说明。

# 结果

## ERG通过诱导细胞周期停滞和衰老降低前列腺细胞的适应性

鉴于全球每年约有600,000例ERG+前列腺癌新诊断病例（50），我们试图阐明ERG过表达对前列腺细胞的影响。我们使用一个编码T2ERG（TMPRSS2-Exon1:ERG-Exon4）融合转录本的慢病毒载体，该转录本受DOX（多西环素）诱导型启动子控制。在22Rv1细胞（一种AR阳性和ETS融合阴性的癌细胞系）中，DOX诱导后1天观察到经典ERG靶基因的预期表达变化，并产生了与内源性T2ERG融合细胞中相当的ERG蛋白水平（补充图S1A和S1B）。更长时间的T2ERG表达导致ERG蛋白水平降低，且与空载或EGFP对照相比细胞适应性降低（图1A和B）。此外，T2ERG诱导还显著损害了软琼脂实验中的无锚定生长能力（图1B）。观察到的表型是ERG依赖性的，因为通过shERG_1和shERG_2降低ERG水平可挽救细胞适应性，而靶向ERG 3′UTR（在过表达的T2ERG中缺失）的shNTC和shERG_3既未降低ERG水平，也未恢复T2ERG过表达细胞的细胞适应性（补充图S1C）。

**图1. ERG独立于AR降低前列腺细胞适应性并诱导细胞周期停滞和衰老。**

A，用EGFP或T2ERG表达载体转导的22Rv1细胞经EtOH（?DOX）或1 μg/mL DOX处理后的免疫印迹。B，用EGFP或T2ERG表达载体转导并以A中相同方式处理的22Rv1细胞的结晶紫染色（左）和软琼脂（右）实验，分别培养8天和28天。软琼脂实验数据以均值±标准差（SD）表示，统计学显著性采用双尾非配对t检验评估（n = 4个生物学重复）。C，用EGFP、T2ERG或T2ERGR367K表达载体转导的LNCaP细胞以A中相同方式处理最多6天后的免疫印迹（上）和结晶紫实验（下）。D，LNCaP-T2ERG细胞在含活性炭剥离血清（CSS）的培养基中培养7天后，用EtOH、1 μg/mL DOX诱导T2ERG和/或10 nmol/L双氢睾酮（DHT）激活AR处理后的RT-qPCR分析（左）及KLK3（AR靶基因）和PLA1A（ERG靶基因）的生长曲线（右）。RT-qPCR数据指处理开始4天后的结果，以对照样品（EtOH-EtOH）为参照，以均值±SD表示（n = 3个生物学重复）。汇合度以均值±SD表示。E，用EtOH或1 μg/mL DOX处理细胞的EdU/PI FACS谱量化。数据以均值±SD表示，统计学显著性采用双尾非配对t检验评估（n = 3个生物学重复）。F，用EtOH或1 μg/mL DOX处理5天（22Rv1）或4天（LNCaP和RWPE-1）后细胞的SA-B-GAL染色代表性图像（左）和量化（右）。数据以均值±SD表示，统计学显著性采用比较不同细胞系中T2ERG DOX和EtOH处理样品的双尾非配对t检验评估。

与22Rv1细胞中的结果一致，ERG降低了AR阳性的LNCaP细胞的适应性（图1C），相比EGFP和T2ERGR367K（ERG的一种突变体形式，其DNA结合能力受损且转录活性降低，补充图S1D；参考文献51、52）。

类似地，ERG 损害了永生化非肿瘤性 RWPE-1 细胞的适应性（补充图 S1E）。我们接下来检查了 ERG 依赖性生长减少是否依赖于 AR 信号通路。表达 T2ERG 并在诱导 14 天后的 AR 阴性 DU145 细胞显示 ERG 蛋白水平随时间降低，并且适应性下降（补充图 S1F）。同样，在含活性炭剥离血清的培养基中培养（以减少 AR 激活）并用 DOX 诱导的 LNCaP-T2ERG 细胞，其增殖能力低于对照细胞（图 1D）。向培养基中加入双氢睾酮以激活 AR 信号通路，尽管总体上增加了细胞增殖，但未能挽救 ERG 降低的细胞适应性（图 1D）。为了表征 ERG 介导的细胞适应性降低，我们使用 EdU-PI 流式细胞术监测了细胞周期分布。与诱导 1 天相比，ERG 表达 4 天或 6 天分别降低了 22Rv1 和 LNCaP 细胞中 S 期细胞的比例（图 1E；补充图 S1G；t 检验 P 值分别为 0.0087 和 0.0035），表明 ERG 诱导细胞周期停滞。此外，ERG 在 22Rv1、LNCaP 和 RWPE-1-T2ERG 细胞中促进衰老（图 1F；t 检验 P 值 = 0.0199）。相比之下，我们在 Annexin V-PI 流式细胞术实验中未观察到 ERG 诱导的细胞凋亡（补充图 S1H）。这些数据扩展了先前关于体外 ERG+ 细胞适应性降低的发现（25, 31, 53），表明 ERG 通过引发细胞周期停滞和衰老来介导这一反应。

ERG 激活 EMT 和衰老并产生异质细胞状态

为了进一步深入了解 ERG 诱导的表型反应，并评估转录调控的致癌过程是否有助于观察到的增殖减少，我们对用乙醇作为对照或用 DOX 处理 4 天的 LNCaP-T2ERG 和 LNCaP-T2ERGR367K 进行了 RNA-seq 分析。ERG 诱导导致 575 个基因上调和 74 个基因下调（FDR < 0.01 且 log2（Fold Change）> 1 或 log2FC < -1，分别对应上调和下调；图 2A；补充表 S1）。相比之下，T2ERGR367K 仅导致 1 个基因差异表达（FDR < 0.01 且 log2FC > 1 或 log2FC < -1；补充图 S2A；补充表 S1）。与已发表的 ERG ChIP-seq 数据（52）整合后，鉴定出 530 个 ERG 结合并调控的基因（补充图 S2B）。GSEA 分析揭示了 143 个正富集的特征集（FDR < 0.05），其中两个与衰老相关（补充图 S2C；补充表 S2），这与 SA-B-GAL 染色检测到的衰老表型一致（图 1F）。与 ERG 诱导的细胞周期停滞一致（图 1E），与 MYC 靶标、G2M 检查点基因和 E2F 靶标相关的特征集被 ERG 下调（FDR < 0.05；图 2B；补充表 S3）。有趣的是，ERG 上调基因富集于 EMT 和炎症通路，包括通过 NFKB 的 TNFA 信号、炎症反应、IFNγ 和 IFNα 反应以及 TGFβ 信号（图 2B；补充表 S3）。ERG 通过 RNA-seq 和 GSEA 在 22Rv1-T2ERG 细胞中确认激活了 EMT（FDR < 0.1；补充图 S2D；补充表 S4 和 S5），并在 RWPE-1-T2ERG 细胞中确认（补充图 S2E），这可能有助于细胞周期停滞（54）。

图 2. 查看大图下载幻灯片：ERG 通过 TGFβ 信号驱动 EMT 和衰老。A，RNA-seq 数据火山图，展示了 LNCaP 细胞中 T2ERG 表达后的基因调控和统计显著性。细胞用乙醇或 1 μg/mL DOX 处理 4 天。红色和蓝色点分别代表显著上调（log2（DOX+/DOX-）> 1）和下调（log2（DOX+/DOX-）< -1）的基因（FDR <0.01）（n = 3 个生物学重复）。B，使用 Hallmark 集合和 A 中数据选择 ERG 结合基因进行 GSEA 分析。显示显著（FDR <0.05）正富集（红色）或负富集（蓝色）的基因集。NES，归一化富集分数；sign.，信号。C，用乙醇或 1 μg/mL DOX 处理 4 天后的细胞免疫印迹。GAPDH 和 ACTB 用作上样对照。l.e.，更长曝光时间。D，用乙醇或 1 μg/mL DOX 处理 4、8 和 13 天的 RWPE-1-T2ERG 细胞的代表性 SA-B-GAL/VIM 流式细胞术图谱（左）和定量（右）。数字表示每个象限中的细胞百分比。数据以平均值 ± 标准误（SEM；n = 3 个生物学重复）表示，并使用双尾非配对 t 检验评估统计显著性。*，P 值 < 0.05；**，P 值 < 0.01；***，P 值 < 0.001。E，A 中使用的 LNCaP-T2ERG 和来自（55, 56）的 RWPE-1-ERG 中 TGFβ 通路组分调控的热图。显示在至少一个 RWPE-1-ERG 数据集中 FDR < 0.05 且在 LNCaP-T2ERG 中一致调控的基因 [log2（DOX+/DOX-）< -0.2 或 >0.2]。aSMAD，激活型 SMAD；coR，共受体；ecAntagonist，胞外拮抗剂；Type2R，II 型受体。F，ERG 在 RWPE-1-T2ERG 细胞中对三个 TGFβ 通路基因（TGFB2、SMAD3 和 TGFBR2）、两个 ERG 靶标（ARHGDIB 和 IFIT3）和一个对照区域的定量 ChIP 实验，处理方式同 A。IgG 用作对照。数据以技术三次重复的平均值 ± 标准差表示。G，用 1 μg/mL DOX 处理 4 天的 RWPE-1 细胞的免疫印迹。ACTB 用作上样对照。H，用乙醇或 1 μg/mL DOX 以及 DMSO、1 μmol/L A8301（ALK4/5/7i）、30 nmol/L PD0325901（MEK1/2i）、10 nmol/L RAPAMYCIN（mTORi）、5 μmol/L TAKINIB（TAK1i）或 10 μmol/L Y27632（ROCK1/2i）处理 4 天的 RWPE-1 细胞的免疫印迹。ACTB 和 GAPDH 用作上样对照。I，G 和 H 中细胞 SA-B-GAL 染色的定量，通过比色测定（shRNA 转导细胞）或流式细胞术（用抑制剂处理的细胞）评估。数据以平均值 ± 标准误（SEM；n = 3 个生物学重复）表示，并使用双尾非配对 t 检验评估统计显著性。**，P 值 < 0.01；***，P 值 < 0.001。

图 2. 查看大图下载幻灯片：ERG 通过 TGFβ 信号驱动 EMT 和衰老。A，RNA-seq 数据火山图，展示了 LNCaP 细胞中 T2ERG 表达后的基因调控和统计显著性。细胞用乙醇或 1 μg/mL DOX 处理 4 天。红色和蓝色点分别代表显著上调（log2（DOX+/DOX-）> 1）和下调（log2（DOX+/DOX-）< -1）的基因（FDR <0.01）（n = 3 个生物学重复）。B，使用 Hallmark 集合和 A 中数据选择 ERG 结合基因进行 GSEA 分析。显示显著（FDR <0.05）正富集（红色）或负富集（蓝色）的基因集。NES，归一化富集分数；sign.，信号。C，用乙醇或 1 μg/mL DOX 处理 4 天后的细胞免疫印迹。GAPDH 和 ACTB 用作上样对照。l.e.，更长曝光时间。D，用乙醇或 1 μg/mL DOX 处理 4、8 和 13 天的 RWPE-1-T2ERG 细胞的代表性 SA-B-GAL/VIM 流式细胞术图谱（左）和定量（右）。数字表示每个象限中的细胞百分比。数据以平均值 ± 标准误（SEM；n = 3 个生物学重复）表示，并使用双尾非配对 t 检验评估统计显著性。*，P 值 < 0.05；**，P 值 < 0.01；***，P 值 < 0.001。E，A 中使用的 LNCaP-T2ERG 和来自（55, 56）的 RWPE-1-ERG 中 TGFβ 通路组分调控的热图。显示在至少一个 RWPE-1-ERG 数据集中 FDR < 0.05 且在 LNCaP-T2ERG 中一致调控的基因 [log2（DOX+/DOX-）< -0.2 或 >0.2]。aSMAD，激活型 SMAD；coR，共受体；ecAntagonist，胞外拮抗剂；Type2R，II 型受体。F，ERG 在 RWPE-1-T2ERG 细胞中对三个 TGFβ 通路基因（TGFB2、SMAD3 和 TGFBR2）、两个 ERG 靶标（ARHGDIB 和 IFIT3）和一个对照区域的定量 ChIP 实验，处理方式同 A。IgG 用作对照。数据以技术三次重复的平均值 ± 标准差表示。G，用 1 μg/mL DOX 处理 4 天的 RWPE-1 细胞的免疫印迹。ACTB 用作上样对照。H，用乙醇或 1 μg/mL DOX 以及 DMSO、1 μmol/L A8301（ALK4/5/7i）、30 nmol/L PD0325901（MEK1/2i）、10 nmol/L RAPAMYCIN（mTORi）、5 μmol/L TAKINIB（TAK1i）或 10 μmol/L Y27632（ROCK1/2i）处理 4 天的 RWPE-1 细胞的免疫印迹。ACTB 和 GAPDH 用作上样对照。I，G 和 H 中细胞 SA-B-GAL 染色的定量，通过比色测定（shRNA 转导细胞）或流式细胞术（用抑制剂处理的细胞）评估。数据以平均值 ± 标准误（SEM；n = 3 个生物学重复）表示，并使用双尾非配对 t 检验评估统计显著性。**，P 值 < 0.01；***，P 值 < 0.001。

图 2. 关闭 图 2. 进一步分析显示 ERG 在不同程度上诱导 EMT。非肿瘤性 RWPE-1-T2ERG 细胞表现出完全的 EMT 表型，其特征是转录因子 ZEB1 和 SOX9 上调，VIM 和 N-cadherin（CDH2）水平增加，同时上皮标志物 E-cadherin（CDH1）下调（图 2C；补充图 S2F）。癌细胞表现出中间表型：22Rv1-T2ERG 细胞上调 SOX9 和 CDH2，但 CDH1 没有降低（图 2C），而 LNCaP-T2ERG 显示 ZEB1（在 RNA 水平）和 SOX9 表达增加，但免疫印迹显示其他 EMT 和上皮标志物无变化（图 2C；补充图 S2G）。流式细胞术分析显示，ERG 过表达后 3% 的 LNCaP 细胞表达 VIM（补充图 S2H），表明只有少数细胞发生完全的 EMT，而大多数细胞保持中间状态或抵抗完全转变。为了确定 EMT 和衰老是否在同一细胞内发生，我们以单细胞分辨率评估了两条通路的激活情况。在 RWPE1-T2ERG 中，诱导后 4 天 16.6% 的细胞同时表达 VIM 和 SA-B-GAL（SA-B-GAL+/VIM+ 细胞），这一比例在 8 天和 13 天增加到约 30%（图 2D；t 检验 P 值 < 0.05）。相反，约 40% 的细胞在整个实验过程中持续仅显示 VIM 表达（SA-B-GAL-/VIM+ 细胞）（t 检验 P 值 < 0.05）。利用我们的 RNA-seq 结果，我们研究了介导 ERG 诱导 EMT 的通路。用 A8301 处理抑制 TGFβ 信号，而不是用 SB202190 和 BAY117082 分别抑制 p38 或 NFKB 通路，减少了 VIM+ 细胞的比例和 CDH2 水平（补充图 S2I 和 S2J）。在 LNCaP-T2ERG 和 RWPE-1-ERG（55, 56）中，ERG 上调了 TGFβ 信号级联的多个组分，包括配体 TGFB2、II 型受体 TGFBR2、共受体 ENG、转录因子 SMAD2 和 SMAD3，以及参与非经典 TGFβ 信号的 AKT3 和 MAP2K3（图 2E；补充图 S2K；补充表 S1）。定量 ChIP 分析显示 TGFB2、SMAD3 和 TGFBR2 与 ERG 结合（图 2F），表明直接转录调控。此外，敲低与经典 TGFβ 信号中的 SMAD2/3 相互作用的 SMAD4，以及用 PD0325901 抑制参与非经典 TGFβ 信号的 MEK1/2，降低了 RWPE-1 细胞中 ERG 介导的 VIM 上调（图 2G 和 H）。抑制其他非经典 TGFβ 通路介质——包括 mTOR（RAPAMYCIN）、TAK1（TAKINIB）和 ROCK1/2（Y27632）——不影响 VIM 水平（图 2H）。支持 ERG 通过 TGFβ 激活 MEK/ERK 通路，ERG 表达增加了 ERK1/2 磷酸化，这一效应被 A8301 联合处理所减弱（图 2H）。有趣的是，抑制 MEK1/2 而不是耗竭 SMAD4 降低了 ERG 诱导的衰老（图 2I）。总之，这些发现表明 ERG 产生异质性细胞状态，其中衰老和 EMT 分别由经典和 MEK/ERK 介导的非经典 TGFβ 信号差异调控。

ERG 促进去分化和中间基底层-腔层细胞群

为了确定 ERG 是否调控细胞可塑性的其他方面并探索 ERG 如何改变前列腺细胞身份，我们转向了能够进行前列腺细胞和前列腺癌分类的转录组特征（37-41）。在 LNCaP 细胞中，ERG 上调基因显著富集于 Lim 乳腺干细胞上调特征、间充质和干细胞样前列腺癌（MSPC）特征以及 FGF 靶标（FDR < 0.05；图 3A），这些特征定义了一种具有干细胞样特征的前列腺癌分子亚型（37, 38, 40）。虽然经典 AR 靶标基因没有显著富集，但在 AR 驱动的前列腺癌（ARPC）中下调的转录本在 ERG 上调基因中富集（分别为 TCGA 雄激素反应和 ARPC 下调；图 3A）。T2ERG 过表达后前列腺腔层和基底层细胞特征上调（FDR < 0.05，图 3A），表明 ERG 促进这两种细胞状态。扩展此分析，我们发现 ERG 还诱导良性前列腺基底层、杯状和丘状上皮细胞的特征基因——这些基因最近被发现表达于双阴性前列腺癌（39）——表明多谱系可塑性（FDR < 0.05；图 3A）。

类似地，22Rv1细胞在T2ERG过表达后显示出Lim乳腺干细胞上调、MSPC上调、基底、club和hillock特征的激活（FDR < 0.05；补充图S3A）。相反，FGF靶标和腔面特征并未显著富集（FDR < 0.05）。相反，这些细胞上调了NE和ARPC下调标志物，下调了雄激素反应和ARPC上调基因（补充图S3A），这与它们的基础NE背景一致（37）。

图3. 查看大图 下载幻灯片
ERG促进细胞可塑性。A，使用前列腺细胞和前列腺癌（PCa）分类的基因集进行GSEA，比较诱导的LNCaP-T2ERG细胞（DOX+）与对照（DOX?）的表达谱。使用ERG结合基因进行分析。红色条表示显著（FDR < 0.05）正性富集的基因集。ARPC，AR驱动的PCa；MSPC，间充质和干细胞样PCa；NEPC，神经内分泌PCa；NES，标准化富集评分。B，用EtOH或1 μg/mL DOX处理4天的细胞的免疫印迹。HSP70和GAPDH用作上样对照。l.e.，延长曝光；Lum，腔面。C，RWPE1-T2ERG和LNCaP-T2ERG细胞如B所述处理的代表性KRT15/KRT18 FACS谱（左）和定量（右）。数据以均值 ± 标准差表示，统计学显著性使用双尾非配对t检验评估（n = 3个生物学重复）。数字表示每个象限中的细胞百分比。D，用1 μg/mL DOX处理4天的RWPE-1-T2ERG和LNCaP-T2ERG细胞的免疫荧光。E，来自（42, 43）的scRNA-seq数据的UMAPs。显示2,187个和1,583个上皮恶性ERG+细胞（分别针对Song 2022和Apostolov 2026），黄色点表示同时表达[ln (cp10K + 1) > 第25百分位数]KRT18和KRT15的细胞。F，E中细胞的箱线图，显示Lim乳腺干细胞上调特征的平均表达。细胞根据KRT18和KRT15表达状态分组[阳性表达：ln (cp10K + 1) > 第25百分位数]。统计学显著性使用Wilcoxon-Mann–Whitney检验评估。箱线图下方的数字表示每组的细胞数量。

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ERG促进细胞可塑性。A，使用前列腺细胞和前列腺癌（PCa）分类的基因集进行GSEA，比较诱导的LNCaP-T2ERG细胞（DOX+）与对照（DOX?）的表达谱。使用ERG结合基因进行分析。红色条表示显著（FDR < 0.05）正性富集的基因集。ARPC，AR驱动的PCa；MSPC，间充质和干细胞样PCa；NEPC，神经内分泌PCa；NES，标准化富集评分。B，用EtOH或1 μg/mL DOX处理4天的细胞的免疫印迹。HSP70和GAPDH用作上样对照。l.e.，延长曝光；Lum，腔面。C，RWPE1-T2ERG和LNCaP-T2ERG细胞如B所述处理的代表性KRT15/KRT18 FACS谱（左）和定量（右）。数据以均值 ± 标准差表示，统计学显著性使用双尾非配对t检验评估（n = 3个生物学重复）。数字表示每个象限中的细胞百分比。D，用1 μg/mL DOX处理4天的RWPE-1-T2ERG和LNCaP-T2ERG细胞的免疫荧光。E，来自（42, 43）的scRNA-seq数据的UMAPs。显示2,187个和1,583个上皮恶性ERG+细胞（分别针对Song 2022和Apostolov 2026），黄色点表示同时表达[ln (cp10K + 1) > 第25百分位数]KRT18和KRT15的细胞。F，E中细胞的箱线图，显示Lim乳腺干细胞上调特征的平均表达。细胞根据KRT18和KRT15表达状态分组[阳性表达：ln (cp10K + 1) > 第25百分位数]。统计学显著性使用Wilcoxon-Mann–Whitney检验评估。箱线图下方的数字表示每组的细胞数量。

在蛋白水平上，ERG在RWPE-1和LNCaP细胞中增加了腔面标志物KRT18和基底标志物KRT15，而22Rv1仅显示KRT15表达增加（图3B）。基底标志物KRT14和KRT5在LNCaP-T2ERG细胞中未被检测到（图3B），而RWPE-1-T2ERG在有或无ERG表达的情况下均显示KRT5的均一表达（补充图S3B）。重要的是，ERG显著增强了KRT18和KRT15在部分细胞中共表达，标志着中间基底-腔面细胞表型的诱导（RWPE-1的t检验P值 = 0.006，LNCaP的t检验P值 = 0.001，图3C和D）。由于这种中间细胞群体与前列腺癌发生有关（57–59），我们的发现表明ERG可能通过作为去分化因子和促进这种中间细胞状态来发挥其致癌作用。我们在MDA前列腺癌2b（AR阳性）细胞系中观察到ERG表达后KRT18/KRT15双阳性细胞比例类似增加，而AR阴性干细胞样细胞DU145和PC-3未显示这种变化（补充图S3C）。在含活性炭剥离血清的培养基中培养LNCaP-T2ERG细胞并未消除这些双阳性细胞的出现（t检验P值 = 0.0368，补充图S3D），排除了AR在ERG介导的去分化中的作用。为了确定ERG+腔面-基底中间细胞是否存在于临床样本中，我们分析了局限性前列腺癌的scRNA-seq数据（42）。在ERG表达细胞中，我们鉴定了共表达KRT18和KRT15的一个亚群（占细胞的0.7%，图3E；补充图S3E）。重要的是，与单一KRT18阳性或双阴性细胞相比，这些细胞表现出更高的干细胞相关基因表达（Wilcoxon P值分别为0.048和2.6E?5，图3F）。对第二个数据集（43）的分析显示ERG+人类肿瘤中KRT18/KRT15双阳性细胞比例更高（占细胞的7.8%），并确认了这些细胞中干细胞相关基因表达更高（图3E和F；补充图S3E）。这支持了我们关于ERG诱导的中间基底-腔面细胞群体的发现。ERG激活p53，而p53缺失增强了ERG诱导的细胞可塑性标志物

在前列腺癌中，TP53缺失和突变经常与ETS融合共发生，并与ETV4和T2ERG协同促进前列腺肿瘤发生和癌症进展（11, 60）。为了检查p53活性是否有助于所识别的ERG介导表型，我们首先检查了p53状态。在RWPE-1、22Rv1和LNCaP细胞中，ERG诱导后检测到p53积累和/或其丝氨酸15位点磷酸化增加（图4A）。p21也被ERG上调，进一步支持p53激活（图4A）。ERG表达不调节TP53转录本（补充表S1和S4），而它一致地增加了所有细胞系中的γH2A.X水平（图4A），表明ERG诱导的DNA损伤可能是p53激活的基础。与该假设一致，在用ATM（KU60019）、ATR（VX970）和p38（SB202190）抑制剂处理的细胞中，ERG诱导时p53磷酸化没有增加——这些激酶调控DNA损伤反应和下游信号传导（图4B）。抑制其他p53激活剂，如DNA-PK（NU7441）、mTOR（雷帕霉素）和活性氧（N-乙酰-L-半胱氨酸），没有这种效果（图4B）。出乎意料的是，在所有条件下p21水平仍然升高。

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p53被ERG激活，其缺失增强了ERG诱导的细胞可塑性标志物而不影响衰老。A，用EtOH或1 μg/mL DOX处理4天的细胞的免疫印迹。GAPDH、HSP70和VINC用作上样对照。l.e.，延长曝光。B，LNCaP-T2ERG细胞用EtOH或1 μg/mL DOX处理4天，并用DMSO作为对照、5 μmol/L NU7441（DNA-PKi）、10 μmol/L KU60019（ATMi）、500 nmol/L VX970（ATRi）、5 μmol/L SB202190（p38i）、20 nmol/L雷帕霉素（mTORi）和2.5 mmol/L NAC（N-乙酰-L-半胱氨酸）处理3小时的免疫印迹。ACTB用作上样对照。C，如A所述处理的LNCaP-T2ERG细胞的免疫印迹（左）和生长曲线（右）。VINC和ACTB用作上样对照。相对汇合度以均值 ± 均值标准误差表示，统计学显著性使用双尾非配对t检验评估（n = 3个生物学重复）。*，P值 < 0.05；**，P值 < 0.01。D，C中使用的细胞的SA-B-GAL染色的定量。实验独立重复两次，导致相似的结果。显示一组数据。E，如A所述处理的LNCaP-T2ERG细胞的免疫印迹。GAPDH和HSP70用作上样对照。

为了直接测试p53在ERG活性背景下的依赖性，我们生成了TP53敲除的LNCaP和RWPE-1细胞（图4C；补充图S4A）。TP53缺失导致p21水平强烈降低和ERG表达LNCaP细胞增殖适度增加（图4C；补充图S4B）。虽然TP53敲除不影响ERG诱导的衰老（图4D；补充图S4C和S4D），但它增强了ERG诱导的细胞可塑性标志物的表达（图4E）。总之，这些结果表明p53被ERG活性诱导的DNA损伤反应部分激活，并且p53缺失可能通过增强细胞可塑性与ERG协同作用。我们调查了可能参与ERG驱动细胞周期停滞的其他介质。除了CDKN1A（编码p21），细胞周期抑制因子CDKN2B（p15）和CDKN1C（p57）在ERG诱导的LNCaP细胞中上调，并且p15水平在TP53耗竭的细胞中仍然升高（补充表S1；图4C）。此外，抑癌基因PTEN的失活经常与ERG融合共发生，共同驱动前列腺癌发生（2, 9, 12）。我们在LNCaP-T2ERG细胞中耗竭了p15和p57，在RWPE-1-T2ERG细胞中耗竭了PTEN，并检测到有无p15、p57或PTEN的ERG表达细胞增殖没有差异（补充图S4E和S4F），表明它们的缺失不能挽救ERG+细胞的增殖缺陷。ERG通过细胞自主和旁分泌机制促进炎症基因表达

在LNCaP和22Rv1中的转录组分析表明ERG上调了多个炎症和衰老相关通路（图2B；补充图S2D），并且与这些通路相关的分泌因子也在RWPE-1中被ERG诱导（t检验P值 < 0.05；图5A）。鉴于炎症和衰老都可以通过调节肿瘤发生和进展的旁分泌机制发挥作用（57, 61），我们进行CM实验以调查ERG是否发挥旁分泌作用。ERG-CM减少了RWPE-1增殖（补充图S5A），增加了SA-β-GAL+/VIM?和SA-β-GAL+/VIM+群体（补充图S5B），并上调了细胞因子（IL1B、IL6和CXCL8）、TNFA–NFKB靶标和一个IFN靶标（t检验P值 < 0.05；图5B），表明ERG诱导的分泌组促进炎症和衰老。

图5. 查看大图 下载幻灯片
炎症基因表达在体外被ERG诱导，并在ERG+肿瘤中上调。A，用EtOH或1 μg/mL DOX处理4天的RWPE-1-T2ERG细胞的RT-qPCR分析。数据相对于EtOH处理样本以均值 ± 均值标准误差（SEM）表示（n = 3个生物学重复用于IGFBP5，n = 4个生物学重复用于其他基因）。B，RWPE-1细胞（左）和人原代前列腺成纤维细胞（右）用来自用EtOH或DOX（1 μg/mL）处理4天的RWPE-1-T2ERG细胞的CM培养4天的RT-qPCR分析。数据相对于EtOH条件样本以均值 ± SEM表示（RWPE-1的n = 4个生物学重复，前列腺成纤维细胞的n = 3个生物学重复）。

C, 分析中使用的人类数据集概述（左图），ERG+与ERG?肿瘤中显著（FDR < 0.05）上调或下调（log2FC > 0.1或log2FC < ?0.1，分别对应上调和下调）的Hallmark基因集的upset图（中图），以及在超过50%的数据集中发生调控的基因集的泡图（右图）。sc，scRNA-seq；sign.，信号通路；n.s.，无统计学显著性。D, STAMPEDE数据集概述（左图）及ERG+与ERG?肿瘤中显著（FDR < 0.005）上调的Hallmark基因集的泡图（右图）。M0和M1指TNM分期分类（无远处转移和有远处转移的证据，分别对应）。E, 小提琴图，显示根据CIBERSORT对TCGA表达数据进行去卷积估计的每位患者M1与M2巨噬细胞丰度比。统计学显著性使用Wilcoxon-Mann–Whitney检验评估。F, 对人前列腺癌（PCa）样本进行CD68（巨噬细胞标志物）、CD163（巨噬细胞标志物）和ERG的免疫组织化学染色。染色在石蜡包埋样本的连续切片上进行。两个样本均归类为Gleason评分3+4和肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期M0。箭头指示巨噬细胞相关信号。G, M0巨噬细胞按B中的方法处理2天后的RT-qPCR分析。数据以EtOH条件化样本为基准，以均值±标准误表示（n = 3个生物学重复）。对于A、B和G，统计学显著性使用双尾非配对t检验评估。*，P值 < 0.05；**，P值 < 0.01；***，P值 < 0.001。对于C和D，统计学显著性使用Wilcoxon-Mann–Whitney检验并结合FDR校正评估。图5. 放大 下载幻灯片 ERG在体外诱导炎症基因表达，并在ERG+肿瘤中上调。A, RWPE-1-T2ERG细胞用EtOH或1 μg/mL DOX处理4天后的RT-qPCR分析。数据以EtOH处理样本为基准，以均值±标准误（SEM；IGFBP5为n = 3个生物学重复，其他基因为n = 4个生物学重复）表示。B, RWPE-1细胞（左图）和人原代前列腺成纤维细胞（右图）用EtOH或DOX（1 μg/mL）处理RWPE-1-T2ERG细胞4天获得的条件培养基（CM）培养4天后的RT-qPCR分析。数据以EtOH条件化样本为基准，以均值±SEM表示（RWPE-1为n = 4个生物学重复，前列腺成纤维细胞为n = 3个生物学重复）。C, 分析中使用的人类数据集概述（左图），ERG+与ERG?肿瘤中显著（FDR < 0.05）上调或下调（log2FC > 0.1或log2FC < ?0.1，分别对应上调和下调）的Hallmark基因集的upset图（中图），以及在超过50%的数据集中发生调控的基因集的泡图（右图）。sc，scRNA-seq；sign.，信号通路；n.s.，无统计学显著性。D, STAMPEDE数据集概述（左图）及ERG+与ERG?肿瘤中显著（FDR < 0.005）上调的Hallmark基因集的泡图（右图）。M0和M1指TNM分期分类（无远处转移和有远处转移的证据，分别对应）。E, 小提琴图，显示根据CIBERSORT对TCGA表达数据进行去卷积估计的每位患者M1与M2巨噬细胞丰度比。统计学显著性使用Wilcoxon-Mann–Whitney检验评估。F, 对人前列腺癌（PCa）样本进行CD68（巨噬细胞标志物）、CD163（巨噬细胞标志物）和ERG的免疫组织化学染色。染色在石蜡包埋样本的连续切片上进行。两个样本均归类为Gleason评分3+4和肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期M0。箭头指示巨噬细胞相关信号。G, M0巨噬细胞按B中的方法处理2天后的RT-qPCR分析。数据以EtOH条件化样本为基准，以均值±标准误表示（n = 3个生物学重复）。对于A、B和G，统计学显著性使用双尾非配对t检验评估。*，P值 < 0.05；**，P值 < 0.01；***，P值 < 0.001。对于C和D，统计学显著性使用Wilcoxon-Mann–Whitney检验并结合FDR校正评估。关闭 图5. 接下来，我们推测ERG诱导的旁分泌效应也可能扩展至非上皮细胞。事实上，暴露于ERG条件培养基（ERG-CM）的人原代前列腺成纤维细胞显示IL1A、IL6和CXCL8上调（t检验P值 < 0.05，图5B），这些是炎症性癌相关成纤维细胞（CAF；参考文献62）和炎症的特征标志物。相比之下，肌成纤维细胞性CAF相关基因ACTA2和CCN2在TGFβ处理下上调，但在ERG-CM处理下未上调（图5B；补充图S5C）。为了评估ERG诱导的炎症在ERG撤除后是否持续存在，我们在RWPE-1细胞中诱导ERG表达4天，随后将其在无DOX培养基中培养长达9天，使ERG水平恢复至基线（补充图S5D）。细胞增殖在第4天恢复（补充图S5D），衰老细胞在第9天基本消失（补充图S5E），炎症基因在第4天和第9天均保持升高——尽管总体呈下降趋势——（t检验P值 < 0.05，补充图S5F），表明ERG诱导的炎症可以独立于持续的ERG表达而维持，且ERG诱导的衰老是可逆的。接下来，我们探讨了促炎通路是否在ERG+人类肿瘤中被激活。我们发现，在三个独立的前列腺癌患者队列——即Taylor等人（2010）（45）、Song等人（2022）（42）以及ARNEO试验中65例高危前列腺癌患者——中，ERG重排与非重排肿瘤之间存在TGFβ信号通路和通过NFKB的TNFA信号通路的上调（Wilcoxon P值，FDR校正后 < 0.05，图5C；补充表S6）。我们还证实了前列腺癌TCGA数据集（扩展版；参考文献2）中TGFβ的上调。接下来，我们查询了STAMPEDE试验（49）中1,325例患者按诊断时转移分期分层的基因表达数据（M0：超高危非转移性；M1：原发转移性），并证实M0 ERG+肿瘤中NFKB通路上调，M0和M1 ERG+前列腺癌中TGFβ上调（Wilcoxon P值，FDR校正后 < 0.005，图5D；补充表S6）。与ERG的促炎作用一致，转录组数据去卷积显示ERG+肿瘤中M1与M2巨噬细胞比率更高（Wilcoxon P值 = 2.9E?8；图5E；补充图S5H；补充表S7）。我们在ERG+ PIN病变（补充图S5I）和前列腺癌组织切片中验证了巨噬细胞浸润，尽管样本量过小，无法检测富集情况（图5F）。更重要的是，ERG-CM在M0巨噬细胞中上调了M1相关炎症基因并下调了M2相关清道夫受体（图5G）。综合而言，这些发现支持了一个模型，即ERG在上皮细胞、基质细胞和髓样细胞中调节炎症基因表达，可能维持炎症微环境。讨论 ERG融合是约半数前列腺癌的特征（2, 3）。基于小鼠模型和人类遗传数据的广泛研究将这些重排确定为前列腺肿瘤发生中的早期事件，当与其他突变结合或以高水平表达时，可驱动癌症起始（4, 7–12）。然而，ERG在前列腺细胞中直接触发的生物程序，独立于共发生的异常，仍未被完整定义。在我们的实验中，ERG的可诱导、时间可控表达使我们能够精确绘制ERG驱动的转录和表型变化图谱，同时最大限度地减少因细胞适应或选择导致的次级效应。此外，聚焦早期时间点也最大限度地减少了ERG水平逐渐下降的影响（图1A和C）。在此背景下，观察到的细胞周期停滞可能反映了对急性高水平ERG表达的短暂应激反应。尽管如此，这种效应仍可能重现体内T2ERG融合形成时的初始细胞反应，在这种反应中，升高的ERG表达是启动肿瘤发生所必需的，且无需额外的异常（8）。我们观察到ERG激活TGFβ信号通路，驱动上皮-间质转化（EMT）和衰老（图2E–I）。SMAD依赖的经典TGFβ信号通路和MEK/ERK介导的非经典TGFβ信号通路此前均被发现参与调控这些过程（63, 64）。我们的数据表明了一种特化模式，SMAD依赖的信号通路主要控制EMT诱导，而ERK1/2则同时调控VIM表达和SA-β-GAL活性（图2G–I）。尽管这种差异调控的机制基础仍有待进一步研究，但部分解释可能在于ERK1/2介导的磷酸化调节ERG转录活性（56）。p53是另一个能够同时控制衰老和细胞可塑性的关键因子（41, 65）。我们检测到ERG诱导后p53活性增加，部分归因于DNA损伤反应的激活（图4A和B）。有趣的是，p53失活并未影响ERG诱导的衰老，但确实增加了ERG诱导的细胞可塑性标志物（图4D和E）。这一初步证据与此前发现一致，即p53缺失可增强成纤维细胞的细胞重编程，并常发生在晚期前列腺癌中，其中谱系可塑性作为治疗耐药机制被激活（41, 65）。ERG诱导细胞可塑性的能力可能对前列腺癌的肿瘤发生和治疗反应都有重要意义。最近，Feng及其同事（66）在小鼠中使用谱系追踪显示，ERG+肿瘤起源于基底-腔面细胞群体，在ERG诱导后产生同时表达基底、腔面、丘状和杯状细胞标志物的中间细胞，并具有干细胞样特征。这一体内证据与我们观察到的ERG诱导的中间基底-腔面细胞群体相一致，结合我们的人类样本分析结果（图3E和F），有力地支持了其功能相关性。此外，最近的研究报道T2ERG融合在对抗雄激素和新辅助AR信号抑制剂治疗无反应的高危局限性前列腺癌患者中过度富集（67, 68）。不禁令人推测ERG诱导的细胞可塑性可能与这种情况相关。然而，需要注意的是，前列腺癌中ERG的表达受AR（1）（即这些治疗的主要靶点）的控制，且ERG+肿瘤细胞依赖ERG存活（15）。这表明了一种功能权衡，即尽管ERG可以促进细胞可塑性，但高度依赖ERG的细胞可能无法利用这一逃逸途径，因为AR信号抑制会损害ERG表达和细胞存活。慢性炎症已被认为是前列腺癌起始和进展的驱动因素（69, 70）。多种内部信号已被描述为前列腺炎症的来源，包括衰老、炎症性髓样来源细胞以及致癌信号，如PTEN缺失驱动的信号（57）。在此，我们显示ERG激活了衰老（图1F、2D和I）和炎症基因表达变化（图2B和5A；补充图S2D）。此外，ERG诱导的炎症通过旁分泌方式在上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞间传播（图5B和G），可能导致潜在的慢性炎症循环。人类样本分析支持了ERG+肿瘤中炎症通路的激活（图5C和D）。目前尚未明确ERG+肿瘤中该炎症的机制细节和作用。多条证据支持ERG诱导的炎症通路的相关性（71–73）。值得注意的是，增殖性炎症性萎缩（PIA）病变携带T2ERG融合，尽管频率较低（74），且在ERG阳性PIA向早期腺癌转变过程中观察到炎症相关的中间杯状样细胞（75）。此外，在T2ERG-PTENflox/flox小鼠模型中给予非甾体抗炎药与高级别腺癌病变发病率降低相关，且患者中发展ERG阳性前列腺癌的风险也降低（76, 77）。衰老细胞通过衰老相关分泌表型（SASP）以自分泌和旁分泌方式维持炎症，并促进免疫抑制和EMT（78）。衰老还伴随着促存活信号的激活，防止细胞凋亡，并出现一种潜在干细胞程序，该程序在细胞周期停滞逃逸时赋予肿瘤起始能力（79）。在此框架下，我们观察到的ERG诱导的双价衰老-EMT细胞状态（图2D）可能作为ERG+细胞在肿瘤发生期间的避难所，使其在持续积累额外促肿瘤特征的同时得以存留。需要更详细地刻画ERG诱导的衰老，以全面阐明ERG如何促进肿瘤起始和进展。这些见解可为基于使用衰老清除剂的"一记重拳，再补一记"策略提供新的治疗机会。总体而言，我们的研究为ERG致癌活性提供了新的见解，并表明进一步研究ERG诱导的去分化、炎症和衰老如何相互关联，将有助于阐明ERG介导的肿瘤发生，并可能发现对大量前列腺癌患者相关的新治疗脆弱性。数据可用性 本研究产生的RNA-seq数据可在BioStudies数据库中获取（http://www.ebi.ac.uk/biostudies），登录号为E-MTAB-15836。

本研究重新分析的公开基因表达数据来源于recount3 R包（https://bioconductor.org/packages/recount3）（PRAD-TCGA；参考文献46）、Gene Expression Omnibus数据库（登录号GSE176031）（Song单细胞RNA测序数据；参考文献42）以及CELLxGENE门户（https://cellxgene.cziscience.com/collections/bdac7a53-fe34-4f04-8c46-f9bd5297c099）（Apostolov单细胞RNA测序数据；参考文献43）。本研究产生的所有其他原始数据可向通讯作者索取。

作者声明利益冲突

E. Grist报告在提交本研究工作之外，从强生公司获得个人费用和非财务支持，并从Veracyte公司获得个人费用；此外，E. Grist持有"用于转移性疾病的Decipher检测"专利（已获授权）以及"PTEN不活性特征"专利（申请中）。S. Joniau报告在研究进行期间，从强生公司和Ferring制药有限公司获得资助、个人费用、非财务支持及其他支持。E. Davicioni是Decipher检测制造商Veracyte公司的员工。G. Attard报告在提交本研究工作之外，从安进、阿斯利康、拜耳、默克公司、Merck Serono公司、赛诺菲、山德士、安捷伦和Artera获得其他支持，从卫材制药、Blue Earth Therapeutics、强生制药、诺华、辉瑞和Veracyte获得资助及其他支持；此外，G. Attard持有血液甲基化标志物专利（GB1915469.9，已获授权），并作为发明人列于多西他赛预测生物标志物（Veracyte）以及英国癌症研究所发现清单中的醋酸阿比特龙上，G. Attard个人获得英国癌症研究所的收益分成。F. Demichelis报告美国专利（7,718,369；8211645，已获授权）。其他作者未报告利益冲突。

作者贡献

F. Lorenzin：构思、数据整理、形式分析、监督、经费获取、调查研究、可视化、方法学、撰写原始稿件、项目管理。G. Fracassi：形式分析、调查研究、可视化、方法学。F. Vannuccini：数据整理、形式分析、调查研究、可视化。M. Ismail：数据整理、形式分析。Y. Ciani：数据整理、形式分析、调查研究。R. Bevilacqua：形式分析、调查研究、可视化。P. Gasperini：调查研究。F.G. Carbone：数据整理、调查研究。S. Cinalli：数据整理、调查研究。E. Grist：数据整理、调查研究。W. Devlies：数据整理、调查研究。A. Giesen：数据整理、调查研究。J. Van Goubergen：数据整理、调查研究。F. Claessens：数据整理、调查研究。S. Joniau：数据整理、调查研究。E. Davicioni：数据整理、调查研究。M. Barbareschi：数据整理、调查研究。D.S. Rickman：资源。A. Lunardi：资源、调查研究。G. Attard：监督、项目管理。A. Zoubeidi：资源、撰写—审阅和编辑。F. Demichelis：构思、监督、经费获取、项目管理、撰写—审阅和编辑。

致谢

我们感谢CIBIO部门核心设施（IRBIO；下一代测序、高通量筛选与验证、细胞分析与分离、细胞技术设施）的支持，该设施由2014至2020年及2021至2027年欧洲区域发展基金资助；感谢Luca Fava共享TP53敲除试剂；感谢Alfonso Urbanucci和Andrea Alimonti进行深入讨论；感谢Demichelis实验室现任和前任成员的贡献。本研究获得欧盟地平线2020研究与创新计划下欧洲研究理事会资助（资助协议号648670，授予F. Demichelis）、前列腺癌基金会青年研究者奖（19YOUN16，授予F. Lorenzin）、AIRC短期奖学金（授予F. Lorenzin）、AIRC意大利奖学金（29926-2023，授予G. Fracassi）、Samuel和Barbara Sternberg基金会（授予F. Demichelis和F. Lorenzin）以及AIRC研究者资助（27893，授予A. Lunardi）。本文所示结果部分基于TCGA研究网络产生的数据（https://www.cancer.gov/tcga）。

注：本文补充数据可在Molecular Cancer Research在线版（http://mcr.aacrjournals.org/）获取。