《Pharmacological Research - Natural Products》：Quercetin modulates oncogenic hub gene expression and triggers intrinsic apoptosis in Hepatocellular Carcinoma cells
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•通过对835个HCC样本进行整合转录组学分析，识别出核心枢纽基因。•根据PPI网络度数、介数中心和接近中心性对枢纽基因进行优先排序。•槲皮素在HepG2和Huh7细胞中表现出最强的细胞毒性（IC50约为68 μM）。•槲皮素调节致癌枢纽基因的表达并诱导内在性凋亡。引言HCC是最
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通过对835个HCC样本进行整合转录组学分析，识别出核心枢纽基因。
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根据PPI网络度数、介数中心和接近中心性对枢纽基因进行优先排序。
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槲皮素在HepG2和Huh7细胞中表现出最强的细胞毒性（IC50约为68 μM）。
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槲皮素调节致癌枢纽基因的表达并诱导内在性凋亡。
引言
HCC是最常见的原发性肝癌，占全球肝癌病例的80%以上[1],[2]。它是全球主要的健康问题，特别是在乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染率较高、黄曲霉素暴露以及其他风险因素（如酗酒和非酒精性脂肪肝病）普遍存在的地区[3][4]。尽管诊断技术和治疗手段有所进步，但由于诊断不及时和复发率高，HCC患者的五年生存率仍低于20%[6][7]。因此，迫切需要更有效且毒性更低的治疗策略，这推动了关于HCC分子机制的研究以及新型治疗靶点的发现[8][9]。
HCC的一个显著特点是其高度失调的分子景观，包括细胞周期调控因子、代谢酶和免疫调节途径的变化[10][11]。像CCNB1、TOP2A和AURKA这样的致癌驱动因子经常过度表达，促进不受控制的增殖和基因组不稳定[12][13]。同时，包括CYP1A2等解毒酶和MBL2等免疫调节基因在内的肿瘤抑制途径通常被沉默[14][15]。理解和针对这些分子紊乱已成为HCC研究的关键领域。
天然化合物，尤其是黄酮类化合物，因其抗癌特性而受到广泛关注[16][17]。槲皮素、 rutin和naringenin是三种被广泛研究的黄酮类化合物，它们能够调节与癌症相关的关键途径，包括增殖、凋亡和氧化应激相关途径[18][19]。研究表明，槲皮素通过干扰细胞周期调控因子和生成ROS来诱导凋亡并抑制细胞增殖[19]。类似地，rutin[20]和naringenin[21]在不同癌症模型中也表现出抗炎和抗增殖作用。这些黄酮类化合物在传统中药中也有着长期的应用，尤其是在用于缓解肝相关疾病的配方中[22]。
本研究旨在：(i) 通过整合多数据集的生物信息学分析，确定在HCC中一致失调的核心转录网络；(ii) 使用基于TCGA的表达数据和生存数据验证关键枢纽基因；(iii) 研究天然黄酮类化合物槲皮素、rutin和naringenin是否能够调节这些枢纽基因并在HCC细胞系中诱导凋亡。这些发现有望为黄酮类化合物在HCC中的进一步临床前评估提供分子基础。
已有研究表明槲皮素、rutin和naringenin具有抗癌作用，但很少有研究将这些作用与HCC中的转录重编程联系起来。例如，槲皮素已被证明可以通过生成ROS和激活caspase来诱导凋亡[23]。本研究通过检查选定致癌基因和代谢基因的mRNA表达变化以及凋亡指标来补充这些发现。同样，虽然rutin和naringenin在其他癌症模型中被报道具有抗增殖作用[18]，但在HCC中观察到的CYP1A2和MBL2 mRNA表达增加的现象尚未得到充分研究，需要进一步的功能验证。
部分摘要
微阵列数据收集与处理
从Gene Expression Omnibus (GEO)数据库（
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中获取了公开可用的基因表达数据集。使用搜索词“Liver”、“HCC”和“hepato”来识别数据集。纳入标准为：(i) 仅限人类肝组织样本；(ii) 未经治疗的HCC肿瘤及其相邻非肿瘤样本；(iii) 无其他原发性疾病或主要并发症；(iv) 每个数据集至少包含六个样本。涉及细胞系或动物模型的研究也被排除。
差异表达基因（DEGs）的识别
为了分析与肝细胞癌（HCC）相关的转录变化，我们分析了八个独立的GEO数据集（GSE14520、GSE45267、GSE55902、GSE62232、GSE84402、GSE77509、GSE101685和GSE121248）。这些数据集共包含835个样本（498个肿瘤样本和337个非肿瘤/相邻组织样本）（表1）。根据|Log2FC| > 1和调整后的P < 0.05的标准，每个数据集都得出了独特的DEGs集合。我们在所有八个数据集中识别出了重叠的DEGs。
讨论
本研究结合了生物信息学和实验方法来识别HCC的分子特征，并研究了槲皮素、rutin和naringenin的体外效应。通过分析八个GEO数据集，我们确定了一组在独立队列中一致改变的137个上调和230个下调的DEGs。这些发现强调了细胞周期失调和代谢障碍在HCC进展中的核心作用，这一点通过体外实验得到了进一步验证。
研究的优势
本研究有几个显著的优势。生物信息学流程整合了八个独立的GEO数据集（共835个样本），提供了一个稳健的基因特征谱，降低了数据集特异性假阳性的风险。实验验证是在两种分子上不同的HCC细胞系——HepG2和Huh7上进行的，提高了研究结果的普遍性。凋亡分析结合了荧光显微镜和Western blot检测BCL-2、BAX等蛋白的方法。
研究的局限性
尽管本研究全面分析了黄酮类化合物对HCC的影响，但仍存在一些局限性。虽然对凋亡调节因子（BCL-2、BAX、Caspase-3、Caspase-9）进行了Western blot验证，但尚未对致癌枢纽基因AURKA、TOP2A和CCNB1进行直接的蛋白质水平验证，这仍是未来研究的重要目标。
建议与未来展望
基于本研究的结果，我们建议未来的研究应优先考虑：(i) 使用HCC异种移植模型体内验证槲皮素的治疗效果；(ii>通过基因过表达或敲低方法验证枢纽基因（AURKA、TOP2A、CCNB1）的调节作用及其机制因果关系；(iii>优化槲皮素的给药方式，以弥合体外 IC50值与生理可实现浓度之间的差距。
结论
这些发现为进一步临床前评估槲皮素及相关黄酮类化合物在HCC中的作用提供了基础。槲皮素治疗与选定枢纽基因的转录水平调节以及内在凋亡途径标记的蛋白质水平激活有关。本研究并未证实枢纽基因的变化直接导致凋亡，也未证明这些效应仅限于HCC细胞，或者约68 μM的剂量能在体内安全实现。此外，
财务支持
本研究未获得公共部门、商业部门或非营利组织的任何特定资助。
CRediT作者贡献声明
Abirami Jeyaprakash：撰写 – 审稿与编辑。Mano Chitra Karthikeyan：撰写 – 审稿与编辑、可视化、格式分析、数据管理。Chandhru Srinivasan：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学研究、数据管理、概念化。Antony Joseph Velanganni Arockiam：验证、监督、项目管理。Prabhakar Kowsika：撰写 – 审稿与编辑、格式分析、数据管理。Indhirakumar
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢CSIR为Chandhru Srinivasan先生提供的奖学金（文件编号：09/0475(11339)/2021-EMR-I.），感谢DST-INSPIRE对Mano Chitra K女士的财政支持（IF200178），感谢RUSA 2.0生物科学项目对Abirami J女士的财政支持，同时也感谢DST-FIST和印度政府对我们部门基础设施改进的资助。我们还要感谢svgrepo（
https://www.svgrepo.com/)为本文提供的免费图标。
Chandhru Srinivasan|Mano Chitra Karthikeyan|Abirami Jeyaprakash|Indhirakumar Murugesan|Antony Joseph Velanganni Arockiam
