《npj Biofilms and Microbiomes》：Recovering anaerobic bacterial genomes in saliva, tumour and blood whole genome sequencing data from patients with prostate cancer
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胃肠道、尿液和前列腺组织中的微生物组成已被与前列腺癌的临床差异联系起来，近期一项荟萃分析将牙周病与该癌症关联。关于特定细菌如何促成前列腺癌发生存在多种假说。从临床样本中恢复微生物基因组及其基因组特征，并研究精细分类学，是探究因果关系的关键第一步。研究人员描述了
胃肠道、尿液和前列腺组织中的微生物组成已被与前列腺癌的临床差异联系起来，近期一项荟萃分析将牙周病与该癌症关联。关于特定细菌如何促成前列腺癌发生存在多种假说。从临床样本中恢复微生物基因组及其基因组特征，并研究精细分类学，是探究因果关系的关键第一步。研究人员描述了与前列腺癌相关样本的微生物多样性。对来自PanProstate Cancer Group、源于血液、唾液样本和前列腺组织全基因组数据（N=247）的非人读段进行宏基因组组装，成功重建249个高完整度细菌基因组，主要来自口腔样本。数据显示18个缺乏物种水平分类的口腔细菌物种，同时也显示出多种已知物种。该方法使研究人员无需额外测序成本即可获得癌症患者微生物的深入认识，并有望揭示可能改善癌症起始与发展理解的新关联。
研究背景方面，2022年前列腺癌为第二常见癌症且为第五大癌症死亡原因，微生物组与菌群失调正被视为前列腺癌促成因素。此前已报道前列腺组织与尿液中可检测细菌，厌氧细菌生物标志物集（Anaerobic Bacterial Biomarker Set，ABBS）中至少一个属的存在可区分PSA进展、转移或死亡高风险男性。但细菌与侵袭性前列腺癌的关联是否因果尚不清楚，细菌基因毒素colibactin、宿主信号激活、免疫调节、代谢改变等机制被提出。人类癌组织全基因组测序（Whole-Genome Sequencing，WGS）数据本用于测人DNA，人源序列占主导，传统基于k-mer或比对的方法在物种水平表现差、易误分类、忽视污染，因此需用宏基因组组装从“隐藏”非人读段中恢复高质量微生物基因组。
研究人员对Pan-Prostate Cancer Group（PPCG）中2176个WGS数据集的非人映射读段先做属水平筛查，选出含Ezakiella、Fenollaria、Peptoniphilus、Porphyromonas、Anaerococcus、Fusobacterium的247个样本（194例患者）进行单样本宏基因组组装，用MetaSPAdes产生contig，MetaBAT分箱，CheckM与CheckM2估完整度/污染，GUNC查嵌合，GTDB-Tk定分类，Traitar3预测表型，OrthoFinder做正交组分析，PhyloPhlAn与IQ-TREE建系统树，并为未培养分类单元设计物种特异性PCR引物验证。
研究结果如下。Metagenomic assembly on non-human reads from human WGS data reveals putative microbial genomes with estimated high completeness and low contamination：从247样本产生1020万contigs，1355个候选bins，按MIMAG标准得249个>90%完整度且<5%污染基因组，其中212个由CheckM2判定高质量，大多来自法国唾液样本。Known genomes isolated from high-quality like genome bins：Porphyromonas为最常见属（35个），其次Prevotella（21）、Tannerella（13）、Ralstonia（12）、Actinomyces（11）、Anaeroglobus（11）；肿瘤样本获21个，含Ralstonia、Sphingomonas、Afipia等。Porphyromonas metagenome assembled genomes (MAGs)：35个Porphyromonas MAG中12个为P. endodontalis，10个P. gingivalis；P. endodontalis MAG与参考基因组平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity，ANI）95.31%–99.93%，仅缺18747 bp（占参考0.9%），除dnaX外必需基因均见于MAG。Unidentified candidatus bacterial species：24/249（9.6%）无≥95% ANI现有物种，全来自唾液；Campylobacter_B一未知种见于5位患者，Nanosyncoccus获5个；研究人员为新分类单元命名如Ca. Porphyromonas leptis等，并用地步特异性PCR+Sanger验证Ca. Porphyromonas leptis。Predicted phenotypic traits associated with Porphyromonas：Boruta选32个性状，Fisher精确检验得9个Porphyromonas特征（明胶水解、精氨酸水解酶、碱性磷酸酶、酪蛋白水解、革兰阴性、胆盐敏感、厌氧生长、杆状/球杆菌、血琼脂生长、吲哚产生）；NMDS邻近属有Anaeroglobus、Prevotella、Tannerella、Bacteroides、Treponema、Capnocytophaga等。Assembly identifies fewer anaerobic bacteria than short read classification：Kraken与mOTUs2在170/247样本重叠检出ABBS；组装敏感性低于读段分类，97/247样本经组装获ABBS。Shell orthogroups identifies genomic features of pathogenic Porphyromonas species：66个Porphyromonas基因组分381核心、341软核心、1557壳（shell）、7035云正交组；聚为两簇，簇1多已知人病原体、蛋白水解与胞内感染相关通路，簇2富碳水化合物利用与较高好氧耐受；去除42个交集后分别获190与241条KEGG通路。
讨论部分总结：研究人员证明可从人本意测人DNA的WGS数据恢复已知与未知MAG，P. endodontalis MAG近参考基因组，但单样本分箱可能带污染，需分离培养、长读长/杂合组装与实验验证。唾液微生物量高故高质量MAG多源于唾液；Sphingomonas等也见于肿瘤，提示常见测序污染物名录应扩展。宏基因组组装敏感性低于Kraken/mOTUs，但能揭多样性与基因层面洞察且零额外成本。与Porphyromonas表型相近的分类单元应进入后续功能研究。该工作扩充ABBS内物种代表性，助力侵略性前列腺癌中微生物基因组特征与因果关系研究，未来应纳入ABBS阴性样本并以健康对照比较。
结论部分翻译：在此，研究人员展示了从前列腺癌患者全基因组测序（WGS）数据恢复已知与推定的未知宏基因组组装基因组（MAG）。研究人员表明，可从本用于测序人DNA的WGS数据中恢复微生物基因组的准确代表。若干推定的未知物种被发现，显著扩展了多个细菌谱系，其中部分先前已与侵略性前列腺癌相关。本研究的P. endodontalis MAG与其代表基因组高度相似，提示其他MAG可能亦具良好质量，但最终仍需分离生物以确认。尽管获得多个“高质量”MAG，未来仍需分离、长/杂合读长测序与实验室验证，以确认无嵌合并夯实基因组特征，这对基于精准基因组学确立未来物种代表亦关键。研究人员报告了推定未知基因组的预测表型以助培养分离，并提供未知菌种特异性引物设计方法。含对照组有助缓解污染，但常见测序污染物与生物相关类群（如Escherichia）重叠仍使研究困难；本研究在Sphingomonas等常被视为污染物类群中获MAG，建议扩展污染物名录。大多数高完整/低污染基因组来自唾液而非肿瘤，因口腔微生物量更高；口腔-前列腺轴与胃肠-前列腺轴均重要，本研究增进对前列腺癌患者胃肠微生物认识。ABBS可能非详尽，应扩至ABBS阴性样本并重查不完全分类单元以精炼标志物。宏基因组组装不宜直接临床应用，其敏感性低于mOTUs/Kraken，但优势在零额外成本下揭多样性与基因洞察。与Porphyromonas表型相近的Anaeroglobus、Prevotella、Tannerella、Bacteroides、Treponema、Capnocytophaga等应在下游研究中检视功能重叠。总体而言，结果扩展了已知物种状态，使癌症患者微生物研究更完整；部分物种源自ABBS，扩充该集内物种将提升识别与侵略性前列腺癌相关的微生物基因组特征之能力，这是探究细菌与侵略性癌发生因果关系所需。未来工作应包括ABBS阴性样本研究，揭示前列腺癌微生物多样性以进行健康-疾病比较，最终有望改进预后模型或提供新治疗路径。
