《Redox Biology》：Isoenzyme-specific determination of glutathione peroxidase activity in cell lysates and GPX1/GPX4-HiBiT cellular target engagement
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研究人员开发了互补检测方法，可在细胞裂解液中定量GPX（glutathione peroxidase，谷胱甘肽过氧化物酶）同工酶特异性活性，并在细胞中检测GPX1/GPX4靶标结合（target engagement）。在硒（selenium，Se）补充的癌细
研究人员开发了互补检测方法，可在细胞裂解液中定量GPX（glutathione peroxidase，谷胱甘肽过氧化物酶）同工酶特异性活性，并在细胞中检测GPX1/GPX4靶标结合（target engagement）。在硒（selenium，Se）补充的癌细胞中，GPX1占大部分GPX活性。HiBiT-CETSA（HiBiT-tagged cellular thermal shift assay，HiBiT标记细胞热位移 assay）可实现高效、按同工酶分辨的细胞靶标结合分析。结果表明GPX1比GPX4更容易被靶向，且不同GPX抑制剂在裂解液抑制和细胞靶标结合方面表现不同。该方法为氧化还原（redox）稳态、铁死亡（ferroptosis）及相关药物发现研究提供了同工酶水平的功能与结合证据。
研究背景方面，GPX抗氧化酶通过含硒半胱氨酸（selenocysteine，Sec）活性位点还原氢过氧化物，维持细胞氧化还原稳态；其中GPX1、GPX2、GPX4等硒蛋白在底物、亚细胞定位、硒依赖性上差异显著。现有问题包括：GPX1与GPX2底物和抑制剂谱高度重叠，粗裂解液中难区分；GPX4因活性低且结合脂类过氧化物，传统GR（glutathione reductase，谷胱甘肽还原酶）偶联NADPH消耗法在裂解液中难检测；传统CETSA依赖抗体、通量低。因此研究人员在《Redox Biology》开展研究，建立粗裂解液GPX1/GPX2特异性活性法，以及内源GPX1/GPX4插入HiBiT的活细胞CETSA，以分辨同工酶活性与细胞靶标结合。
主要关键技术方法包括：以CHP（cumene hydroperoxide，枯烯氢过氧化物）为底物、auranofin选择性抑制GPX1/GPX2的GR偶联NADPH消耗裂解液活性法；利用HT-29细胞GPX1敲低（knockdown，KD）与GPX2 KD验证同工酶贡献；通过CRISPR-Cas9在HT1080细胞中内源插入HiBiT肽段建立GPX1-HiBiT与GPX4-HiBiT单克隆/多克隆细胞系；以HiBiT-LgBiT发光读取的可扩展活细胞CETSA评估化合物热稳定性改变即靶标结合；样本来自A549、HEPG2、HT1080、MDA-MB-453、HT-29等人类癌细胞系。
研究结果如下。Development of a GPX1/GPX2 isoenzyme-specific enzymatic assay compatible with crude cell lysates：研究人员比较HEPG2、HT1080、A549裂解液总GPX活性，选HT1080建模；重组酶加样显示auranofin抑制GPX1而不抑制GPX4；TrxR1（thioredoxin reductase 1，硫氧还蛋白还原酶1）不直接干扰GPX读数，TRi-1不影响GPX活性而抑制TrxR1，证明方法特异。
Probing the GPX assay using GPX1 and GPX2 knockdown cells：在HT-29 SCR（scramble，乱序对照）、GPX1 KD、GPX2 KD中，GPX1 KD总活性约为SCR四分之一，GPX2 KD与SCR接近；免疫印迹见GPX1蛋白缺失才伴活性大幅下降，说明硒补充HT-29中GPX1是CHP还原主要来源。
Total GPX activity in cell lysates is selenium dependent and correlates with GPX1 protein levels across cancer cell types：在HT1080、A549、MDA-MB-453、HEPG2中，无硒时总GPX活性与GPX1/2/4蛋白均极低；补硒后GPX1/GPX2活性占58%至82%，且与GPX1蛋白量显著相关，与GPX2蛋白不相关；非GPX1/GPX2活性与GPX4蛋白不相关，提示还存在其他GSH非依赖或auranofin不敏感过氧化物还原活动。
Evaluation of total GPX and specific GPX1/GPX2 activity in lysate treated with GPX-targeting compounds：用auranofin、ceftibuten、omapatrilat及RSL3处理HT1080裂解液，前三者抑GPX1/GPX2，omapatrilat最强；RSL3不抑制裂解液总GPX或GPX1/GPX2活性，说明其细胞效应不能由裂解液活性法印证。
Development of GPX1-HiBiT and GPX4-HiBiT cell lines：CRISPR-Cas9仅在C端插入获稳定NLuc（NanoLuc luciferase，纳米萤光素酶）信号；Western blot确认GPX1-HiBiT、GPX4-HiBiT表达具硒响应；选55°C测GPX4-HiBiT、60°C测GPX1-HiBiT，使稳定与去稳定均可检。
Evaluation of GPX lysate inhibition, GPX1-HiBiT and GPX4-HiBiT target engagement by putative GPX isoenzyme inhibitors：活细胞CETSA中RSL3、ML-162、PACMA-31使GPX4-HiBiT剂量依赖性热去稳定，RSL3轻度去稳定GPX1-HiBiT；ML-210仅轻度稳定GPX4-HiBiT；auranofin更易影响GPX1而非GPX4。裂解液抑制、纯酶IC50与细胞热位移并不总是一致，说明活性抑制和物理靶标结合是不同维度。
总结讨论部分：研究人员指出GPX1在硒充足癌细胞中主导胞浆/可溶相氢过氧化物还原，auranofin可作为区分GPX1/GPX2与GPX4的工具药；GPX4在裂解液活性法中贡献低，但其膜相关磷脂氢过氧化物还原功能可由HiBiT-CETSA在活细胞中评估。不同化合物在生化、裂解液、活细胞三层面表现分化，提示靶点结合、催化抑制、细胞摄取、脂溶性及脱靶均影响药效。
研究结论部分翻译：互补检测可定量细胞裂解液GPX同工酶特异性活性与GPX1/GPX4细胞靶标结合；硒补充癌细胞中GPX1占大部GPX活性；HiBiT-CETSA实现高效、同工酶分辨的细胞靶标结合分析；GPX1比GPX4更易被靶向；不同GPX抑制剂在裂解液抑制与细胞靶标结合上存在差异。该研究为GPX靶向药物与铁死亡机制研究提供了可高通量化的同工酶水平实验平台。
