《Sensors and Actuators B: Chemical》：Fragment Assembly-Driven
De Novo Engineering of Cyclic Peptide Scaffolds for Fluorescent Biosensing: A Novel Strategy for Small-Molecule Detection
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``•通过亲和片段组装构建的高亲和力环状肽。•这种策略克服了小分子靶标中相互作用位点稀缺的问题。•已经开发出了Pep-1-FITC和Tb-MOF之间的间接荧光增强（IFE）技术。•将计算设计与小分子检测感测技术相结合。引言快速而灵敏地检测小分子在多个领域都至关重要，包括临床诊断、
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通过亲和片段组装构建的高亲和力环状肽。
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这种策略克服了小分子靶标中相互作用位点稀缺的问题。
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已经开发出了Pep-1-FITC和Tb-MOF之间的间接荧光增强（IFE）技术。
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将计算设计与小分子检测感测技术相结合。
引言
快速而灵敏地检测小分子在多个领域都至关重要，包括临床诊断、环境监测、食品安全和药物发现[1]、[2]、[3]。然而，由于小分子体积小、结构多样性高、动态浓度范围广，并且容易被复杂基质中共存的物质干扰，因此对其高选择性和灵敏度地进行精确识别和定量分析仍然是分析化学中的一个持续核心挑战[4]。目前，用于小分子检测的生物识别元件主要包括抗体、适配体、分子印迹聚合物和肽[5]。然而，这些方法存在一些缺点：抗体的耐受性较差、开发周期长且成本高，适配体筛选难度大，以及在复杂基质中分子印迹技术的选择性不足[6]、[7]、[8]、[9]。因此，迫切需要开发出结合了结构简洁性、合成便捷性和强靶向性的新型生物识别元件，以满足小分子识别和检测的需求。
与高分子抗体相比，短肽由较少的氨基酸组成。这种结构上的简洁性直接释放了固相肽合成（SPPS）技术的全部潜力，该技术能够显著缩短生产周期、提高序列可控性，并便于进行定点修饰[10]、[11]。此外，我们之前的研究表明，线性短肽可以稳定地结合OTA，并成功用于基于纳米花瓣结构的发光传感[12]。然而，与线性肽相比，环状肽通过头尾或侧链环化引入了构象限制，这大大降低了分子的自由度并使肽骨架变得更加刚性[13]。这种环化不仅增强了构象预组织性和酶促/环境稳定性，还为构建具有精确空间限制的识别界面提供了结构基础。通过严格控制功能基团的排列，环状肽在形成稳定、定义明确的结合口袋方面优于线性肽，尤其是在目标识别依赖于局部空间限制和协同非共价相互作用（例如，氢键、疏水效应、静电力和π-π堆叠）时[14]、[15]。这些优点使得环状肽成为开发下一代小分子生物识别元件的极具前景的平台。
目前，高亲和力环状肽的计算设计策略大致分为自上而下（Top-Down）和从头算（De novo）两种方法[16]。与自上而下的方法不同，从头算方法不受已知模板序列的限制，能够根据目标的几何特征直接构建环状肽[17]、[18]。这种独立的范式提供了无与伦比的结构灵活性和序列创新性，特别适合于那些缺乏天然结合模板的小分子。当前的头算工作流程通常利用先进的骨架生成算法（如SE(3)扩散模型、RFdiffusion模型和Rosetta套件）来构建刚性骨架，随后通过ProteinMPNN和LigandMPNN等蛋白质设计网络进行目标特异性侧链优化[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。与具有广泛溶剂可及表面的蛋白质不同，小分子的结合表面积非常有限，这要求对弱非共价力进行极其精确的空间对齐[24]。因此，传统的全局生成算法往往无法详细捕捉这些局部微环境要求；在单次计算过程中生成整个环状序列往往无法实现协调复杂协同相互作用所需的结构分辨率，最终导致结合口袋不匹配[25]。为了克服将肽识别从高分子靶向转向小分子生物传感的设计挑战，需要一种新的策略，即采用混合多尺度组装协议，从而能够合理设计高亲和力序列。片段组装策略通过在骨架构建之前筛选蛋白质衍生的肽片段与小分子目标特定区域的良好局部接触，引入目标特定的几何限制，缩小搜索空间，并允许后续序列优化将这些选定的接触整合到一个连贯的结合口袋中。这种方法利用了蛋白质衍生片段的构象预组织和化学多样性，将一个受限制较大的全局搜索转化为一系列局部受限的识别问题——这一概念在基于片段的药物发现和基于片段的环状肽设计中已被证明是有效的[26]、[27]。
然而，获得高亲和力环状肽仅仅是第一步，生物传感器开发中的另一个挑战在于将这些不产信号的结合事件有效地转化为可测量的输出。从机制上看，小分子的体积小以及环状肽丰富的化学修饰位点使其非常适合集成到光学传感支架中[28]、[29]。在各种信号读取策略中，基于荧光的方法提供了更直观的信号获取方式，并能够实现均匀检测[30]。特别是由内部滤波效应（IFE）驱动的荧光平台由于其简单的机制和简化的系统构建而受到持续关注，为将环状肽识别与高灵敏度的光转导相结合提供了强大的范例[31]。IFE的核心原理是吸收剂竞争性地吸收激发光或发射光，只要其吸收光谱与荧光团的激发光或发射光谱有效重叠，就能诱导出可测量的荧光变化[32]。因此，通过选择适当的内部滤波荧光系统，有望将目标识别能力与信号转导功能结合起来，从而实现一步生物传感。
在这项工作中，我们提出了一种基于片段组装的首创工程设计策略，用于构建能够特异性识别蔗糖的高亲和力环状肽支架，这在食品检测中需要克服共存天然糖类和其他结构相似甜味剂的干扰[33]。尽管所得环状肽仅由16个氨基酸组成，但它们表现出高亲和力和与蔗糖良好的结构互补性。在此基础上，进一步开发了一种基于IFE的检测系统，用于实际样品中蔗糖的定量分析。通过监测荧光信号的变化，可以实现蔗糖的快速检测。总之，本文从目标小分子的结构和性质出发，系统地展示了高亲和力环状肽的设计途径及其在微量检测中的潜在应用，为开发高性能的小分子识别亲和元件提供了宝贵的见解和方法参考。
章节摘录
优化环状肽长度以提高亲和力
为了初步探究环状肽长度对结合亲和力的影响，使用Rosetta生成了涵盖4到20个残基的随机构象的环状肽，从而评估环大小对环化几何结构和口袋形成的影响。不同氨基酸残基的环状肽筛选参数详见表S1。如图S1所示，短环状肽（4-5个残基）未能在蔗糖周围形成有效的结合腔
结论
在这项研究中，以蔗糖作为典型代表，我们建立了一种基于片段组装的从头算（De Novo）设计策略，用于开发小分子的高亲和力环状肽。这种策略的优势在于它从穷尽序列空间探索转变为目标的模块化组装。通过利用一个包含500万个五肽片段的精心策划的库，我们将复杂的全局优化转化为一个可行的组装过程，显著减少了搜索
支持信息
包括模拟参数、实验中使用设备、策略的具体细节以及额外的计算结果和实验数据。
CRediT作者贡献声明
Sibo Shi：撰写——初稿，研究，数据管理。Zhenqi Sun：撰写——初稿，研究，数据管理。Jun Liu：验证，研究。Lihong Yu：方法学，研究。Xiaofang Shen：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理，方法学，资金获取，概念化。Yuehong Pang：撰写——审稿与编辑，项目管理，方法学，概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们非常感谢国家自然科学基金（22476068）的财政支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
Zhenqi Sun|Sibo Shi|Lihong Yu|Jun Liu|Yuehong Pang|Xiaofang Shen
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