基于肽协同抗污和阳极/阴极共放大的比率型生物传感器用于灵敏准确检测神经细胞特异性烯醇化酶

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Ratiometric biosensor based on peptide synergistic antifouling and anode/cathode co-amplification for sensitive and accurate detection of neuron-specific enolase

　　

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  开发基于生物肽的水凝胶，具有协同抗污功能用于界面修饰。
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  Ag NCs的自组装和Ru(dcbpy)?2?的聚集实现了阴极/阳极信号的协同放大。
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  双功能探针触发了Ag NWs和Ru(dcbpy)?2?的双向动态信号变化。
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  所设计的抗污比率型生物传感器在血清介质中实现了对NSE的灵敏准确检测。

引言

目前，具有高灵敏度和快速响应特性的电化学发光（ECL）技术已成为诊断各种疾病的重要工具[1]，[2]，[3]。然而，复杂生物基质中干扰蛋白的非特异性吸附很容易污染传感界面，导致生物传感器的信号漂移和使用寿命衰减[4]，[5]。因此，开发具有生物相容性的抗污材料已成为迫切需求。其中，水凝胶的高亲水性使其成为理想的抗污涂层[6]，[7]，[8]。同时，具有特定氨基酸序列的两性离子生物肽能与水分子强烈相互作用，形成致密的水化层以抵抗非特异性吸附[9]，[10]，[11]。基于此，研究人员考虑将生物肽封装在水凝胶中作为复合抗污基质。两种抗污成分的协同效应不仅进一步提高了界面的抗干扰能力，还弥补了水凝胶生物相容性和韧性较低以及游离肽稳定性较差（尤其是线性肽）的不足。水凝胶与肽的有效整合为构建高性能、生物相容性良好的抗污系统提供了理论支持和技术参考。

银纳米团簇（Ag NCs）因其独特的量子尺寸效应、高导电性和可调的光学性质而受到广泛关注[12]，[13]。然而，荧光（FL）量子产率低和稳定性差的缺点极大地限制了其应用[14]，[15]。自组装策略通过调节Ag NCs的空间排列，增强了其稳定性和功能协同性，从而实现了光信号的有效放大[16]。在此基础上，所开发的自组装银纳米线（Ag NWs）表现出高的ECL效率。此外，将自组装的Ag NWs封装在抗污凝胶基质中，不仅赋予了抗污成分发光功能，还促进了界面电子转移，为构建高度集成的基于凝胶的生物传感器提供了新策略。

免疫分析中检测结果的可靠性至关重要。为了提高生物传感器的准确性，除了抵抗复杂检测环境中的无关干扰物外，消除仪器和背景误差也很重要，而比率型传感策略在上述方面具有显著优势[17]，[18]，[19]，[20]。因此，设计了一种双功能探针，可同时触发阴极和阳极信号的动态变化。一方面，利用金纳米颗粒（Au NPs）与Ag NWs之间的共振能量转移（RET）来猝灭Ag NWs的ECL信号。另一方面，大量Ru(dcbpy)?2?被负载在Au NPs的功能化表面上，导致阳极信号强烈自开。双向响应的相对变化抵消了外部干扰因素对单一信号的负面影响，从而减少环境造成的检测偏差，提高检测准确性。

本研究构建了一种基于协同抗污的比率型ECL生物传感器，用于灵敏检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）。具体而言，选择聚丙烯酰胺水凝胶作为载体，其规则的三维网络结构为肽（Fmoc-CHWWEKEKEKEK）提供了可控的空间框架，这不仅解决了抗污生物肽容易脱落的问题，还提高了凝胶界面的稳定性和抗吸附效果。其次，Ag NCs的自组装实现了阴极信号的显著放大。同时，Ru(dcbpy)?2?在金纳米颗粒上的有效聚集放大了传感系统的阳极发射。阴极和阳极响应的协同放大有效提高了初始输出信号，从而增强了检测灵敏度。此外，由Apt-Au NPs-Ru（Ru(dcbpy)?2?: Ru）探针引起的双极性信号反向变化避免了外部干扰物，提高了检测结果的置信度。所设计的多功能、高度集成的基于凝胶的抗污生物传感器在复杂基质中实现了对NSE的准确检测，检测限低至3.19 fg/mL，有助于小细胞肺癌（SCLC）的临床诊断。

章节摘要

试剂与仪器

试剂和仪器的详细信息见补充材料。

Ag NWs的合成

Ag NWs通过水热合成方法制备[21]。具体而言，将170 mg的AgNO₃和155 mg的2-巯基苯甲酸分散在6 mL超纯水中，然后向上述混合溶液中加入0.5 mL的NH₃·H₂O。随后，将所得混合溶液在室温下超声处理20 min以获得Ag NCs。最后，加入乙醇，其体积百分比为

Ag NWs的表征

采用小角X射线散射（SAXS）测量研究Ag NWs的结构。如图1A所示，检测到一系列峰，可指定为面心立方相。具体而言，4.76、5.70和9.31 nm^-1处的峰对应于(113)、(004)和(226)晶面。此外，11 nm^-1以上存在尖锐峰表明有结晶纤维存在[23]，[24]。在图1B-D中，透射电子显微镜（TEM）图像

结论

总之，本研究构建了一种具有协同抗污和阴极/阳极信号放大功能的比率型ECL生物传感器，用于超灵敏测定NSE。首先，通过一步法设计的基于肽的凝胶抗污基底表现出良好的亲水性，有效缓解了电极界面的非特异性吸附或生物污垢。其次，将具有高ECL效率的自组装Ag NWs封装在基质中形成

附录A. 补充数据

材料、设计的DNA链序列、仪器、Au NPs的合成、测量条件、Ag NWs的表征、所开发传感界面的接触角、ECL效率的计算、RET过程的验证、条件优化、生物传感器构建过程的表征、生物传感器的储存稳定性以及与其他方法的比较。

CRediT作者贡献声明

Yvjiao Yan：调查研究。Wenxin Qu：撰写——初稿。Xianzhen Song：正式分析。Yicheng Zuo：软件。Caifeng Ding：获取资金。Lu Zhao：项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们不存在任何已知的财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（22504069和22374086）、山东省泰山学者基金会（tstp20231227）、青岛市博士后科学基金（QDBSH20250101064）和青岛市自然科学基金重点项目（24-8-4zrjj-7-jch）的资助。

Wenxin Qu女士目前是青岛科技大学的硕士研究生候选人。她的研究方向为电化学发光生物传感器。

Wenxin Qu|Yvjiao Yan|Yicheng Zuo|Xianzhen Song|Lu Zhao|Caifeng Ding