《SLAS Discovery》：Patient-derived 3d cell models as new approach methodologies: Applications, advances, and challenges for increased-throughput assays
编辑推荐：
摘要专业翻译
患者源性三维（3D）细胞模型是一种新方法学（NAMs），它弥合了传统二维（2D）细胞培养与体内模型之间的差距，使其在提高通量筛选（ITS）和二次检测中具有吸引力。在这篇综述中，研究人员概述了应用患者源性3D细胞模型的筛选方案，重点是基于患者源性类
摘要专业翻译
患者源性三维（3D）细胞模型是一种新方法学（NAMs），它弥合了传统二维（2D）细胞培养与体内模型之间的差距，使其在提高通量筛选（ITS）和二次检测中具有吸引力。在这篇综述中，研究人员概述了应用患者源性3D细胞模型的筛选方案，重点是基于患者源性类器官（PDO）的检测，涵盖肿瘤学、毒性测试和罕见病药物发现领域。研究人员总结了如何利用肿瘤和非肿瘤类器官在96孔至1536孔板格式中发现新的药物靶点、优先选择标准治疗方案以及模拟动态病理生理过程。随后，研究人员强调了在铺板策略、检测设计和先进检测输出方面的进展，这些进展实现了半自动化和全自动化流程。最后，研究人员讨论了持续存在的挑战，包括异质性、检测标准化以及有限的公开可用方案，并提出了未来方向，例如与免疫和基质区室的整合，以及国家层面的标准化努力，以提高可重复性和转化影响力。
论文解读文章
研究背景与现存问题
传统的二维（2D）细胞培养虽然广泛应用于基础研究和药物筛选，但其无法真实再现体内组织的复杂三维（3D）结构和微环境，导致许多候选药物在临床前阶段表现良好，却在临床试验中因疗效不足或毒性过高而失败。动物模型虽能提供更接近人体的生理环境，但成本高昂、周期长，且存在种属差异，难以完全预测人体反应。因此，开发能够更好模拟人体组织生理和病理状态的新方法学（NAMs）成为迫切需求。
患者源性类器官（PDO）作为一种新型3D细胞模型，能够从患者原代组织（如活检或手术标本）、已建立的细胞系或诱导多能干细胞（iPSCs）分化而来，通过内在的细胞-细胞和细胞-基质相互作用自我组织，重现原生组织的结构、基因组特征和异质性。这使得PDO成为连接2D培养与体内模型的理想桥梁。然而，将PDO应用于提高通量筛选（ITS）仍面临诸多挑战，包括类器官尺寸、细胞组成和分化程度的异质性影响实验可重复性，对生物细胞外基质（ECM）的依赖、复杂的培养基配方，以及自动化所需的专用设备（如药物打印机和机器人）等基础设施的限制。
研究目的与意义
本研究旨在系统综述基于患者源性3D细胞模型（尤其是PDO）在ITS中的应用现状、技术进展及面临的挑战。通过总结肿瘤学、毒性测试和罕见病药物发现领域的成功案例，并分析自动化铺板、先进检测读数和数据分析方法的进步，该综述为将PDO纳入高通量药物筛选管线提供了全面的路线图。其重要意义在于：一方面，PDO保留了患者特异性生物学特征，可用于识别新的药物易感性、优化现有治疗方案，并预测人群层面的治疗反应；另一方面，ITS平台能够快速评估大规模化合物库，加速新药研发和药物重定位，尤其是在缺乏有效治疗方案的罕见遗传病中，提供低成本、高通量的体外测试平台。
主要关键技术方法
研究人员为开展研究，采用了以下关键技术方法：
- 1.
类器官生成与培养技术：建立了从多种肿瘤组织（如胰腺导管腺癌PDAC、结直肠癌CRC、乳腺癌等）及非肿瘤组织（如肝脏、心脏、肾脏、脑）可靠衍生类器官的方案，包括从患者手术标本直接建立PDO，以及利用诱导多能干细胞（iPSCs）分化为特定组织类器官。
- 2.
自动化铺板与微流控芯片技术：采用96孔、384孔及1536孔板进行高密度铺板，结合手动或自动化液滴播种（如磁力纳米颗粒生物打印）实现均一化接种。同时引入微流控芯片平台，更好地模拟体内灌注环境和剪切应力。
- 3.
多功能检测读数技术：综合运用发光法（如CellTiter-Glo检测细胞活力）、荧光成像（活/死染色、免疫荧光标记蛋白表达）、明场形态学分析、功能检测（如毛喉素诱导肿胀FIS测量囊性纤维化跨膜传导调节因子CFTR功能）以及转录组学和蛋白质组学分析，实现对类器官形态、活力、功能和分子特征的实时、多模态评估。
- 4.
自动化数据采集与分析流程：开发了基于深度学习的图像分析算法（如U-Net、V-Net）用于自动分割和量化类器官形态参数，并结合机器学习模型处理大规模筛选数据，提升数据处理效率和准确性。
研究结果
2. 类器官提高通量检测应用
- •
2.1 肿瘤来源类器官的应用：药物发现与药物敏感性分析
- •
研究发现：PDO-ITS最广泛的应用于实体瘤治疗，尤其是PDAC和CRC。例如，Hou等在384孔板中以2μM浓度筛选3290种获批药物，鉴定出三种针对PDAC的新型药物类别（蛋白酶体抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和蛋白质合成抑制剂）。Fernandez-Vega等在1536孔板中筛选15万种化合物，发现711种对PDAC有毒性作用的独特化合物。
- •
结论：PDO-ITS可高效识别新型抗癌药物靶点和重定位现有药物。通过联合基因组分析，可针对特定突变谱系（如KRAS突变CRC）进行精准筛选。此外，PDO还能反映临床治疗反应，如HER2阳性乳腺癌类器官对HER2通路抑制更敏感，BRCA1/2突变肿瘤对PARP抑制剂更敏感。然而，大多数研究仅证明可行性，缺乏体内验证，且类器官扩增耗时较长限制了其在精准医疗中的即时应用。
- •
2.2 非肿瘤来源类器官的应用：毒性评价、罕见病筛选及复杂疾病模型
- •
研究发现：非肿瘤类器官被广泛用于药物毒性测试（如肝、肾、心脏毒性）和罕见病建模（如囊性纤维化CF）。例如，Shinozawa等利用人肝脏类器官平台评估238种上市药物的肝损伤风险，结合细胞活力、胆汁淤积功能和线粒体毒性等多指标读出。dePoel等利用来自76位个体的肠道类器官，在384孔板中通过毛喉素诱导肿胀（FIS）功能检测，筛选1400种FDA批准化合物，为携带罕见CFTR基因突变的患者寻找潜在疗法。
- •
结论：非肿瘤类器官ITS能够模拟正常组织的生理功能和对药物的毒性反应，可作为药物安全性的一级过滤器。同时，该类器官还可用于构建复杂疾病模型（如肝纤维化、心肌收缩功能评估），并可通过共培养体系（如肿瘤类器官与成纤维细胞）研究细胞间相互作用。这些研究表明，非肿瘤类器官ITS在药物发现、毒性预测和个性化医疗方面具有巨大潜力，但多数研究仍需进一步临床前验证。
3. 基于类器官的提高通量筛选进展
- •
3.1 类器官生成与培养技术
- •
研究发现：过去十年，可衍生类器官的组织类型显著增加，尤其是多种肿瘤类型。对于乳腺癌、胰腺癌等，已建立了从患者组织中可靠衍生并扩增类器官的稳健方案，并可结合基因组分析鉴定可靶向突变。对于不易获取的组织（如脑、心脏），则通过iPSCs分化的方法，模拟胚胎发育过程，获得功能性类器官。
- •
结论：可靠的类器官生成和扩增方案是ITS的基础。通过优化培养条件，可以获得足够数量且具有均一性的类器官，为后续高通量筛选提供充足的细胞材料。
- •
3.2 类器官铺板
- •
研究发现：铺板策略直接影响下游检测质量。常用方法包括将类器官悬浮于基底膜提取物（BME）中形成“穹顶状”或“浆液状”分布。自动化铺板（如喷墨、声波或微螺线管阀法）可实现高通量、均一化接种，但需解决高粘度BME带来的剪切应力问题。此外，微流控芯片平台能更好地模拟体内流体动力学环境，适用于多种组织类型。
- •
结论：优化铺板密度（如每孔20-50个类器官）和BME浓度（35%-50%）可减少类器官重叠，确保单平面成像的准确性。无ECM铺板技术（如磁力纳米颗粒生物打印）可规避BME粘度问题，提高自动化兼容性。微流控芯片为动态培养和实时监测提供了更优的平台。
- •
3.3 检测读数与数据分析
- •
研究发现：先进的检测读数包括高内涵成像（明场、荧光、免疫荧光）、发光法活力检测、功能检测（如电生理记录、钙离子成像）以及分泌组分析。数据分析方面，深度学习算法（如U-Net、V-Net）被用于自动分割和量化类器官形态，机器学习模型用于识别药物响应模式。
- •
结论：多模态检测读数能够全面评估类器官的药物响应，而自动化图像分析和数据挖掘工具极大地提高了数据处理速度和准确性，使大规模ITS成为可能。然而，不同实验室间的数据标准化和协议共享仍是亟待解决的问题。
总结与讨论
尽管基于PDO的ITS在药物发现和毒性测试中展现出巨大潜力，但仍面临显著挑战。首先，类器官的异质性（包括大小、细胞组成和分化程度）影响实验的可重复性和定量分析的可靠性，但这种源于患者的异质性也正是其优势所在，有助于识别更广泛的群体反应和应答亚群。其次，标准化不足是限制其广泛应用的主要障碍，包括缺乏统一的培养协议、质量控制指标和数据分析标准。此外，多数研究仅停留在概念验证阶段，缺乏体内验证和临床转化证据。
研究人员总结认为，未来的发展方向应包括：1）建立国家层面的标准化努力，制定统一的类器官培养、处理和检测协议；2）整合免疫细胞和基质细胞成分，构建更复杂的肿瘤微环境模型；3）开发更先进的自动化平台和人工智能分析工具，进一步提高通量和数据一致性；4）加强多中心合作，扩大类器官生物库的规模和多样性，以增强研究结果的普适性和临床转化价值。通过这些努力，PDO-ITS有望成为临床前药物开发和精准医学中不可或缺的核心工具。
