基于红外振动指纹图谱的核酸甲基化检测及其圆二色性结构验证

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Infrared vibrational fingerprinting for the detection of nucleic acid methylation with structural validation by circular dichroism

• ATR-FTIR和CD技术揭示了快速且无需标记的甲基化检测方法。• 核酸在低浓度下可通过ATR-FTIR和CD技术进行检测。• FTIR技术揭示了对与甲基相关的振动特征的敏感性。• ATR-FTIR技术在约500 ng/μL以上浓度对RNA和DNA显示出最佳的CH?分辨率。• CD技术确认了核酸浓度与旋光度之间的强线性关系。引言核酸甲基化在调控基因表达、核糖核酸（RNA）代谢和染色质组织中发挥核心作用。RNA修饰（如m1A和m?A）和DNA甲基化（如5-甲基胞嘧啶）已成为癌症生物学和细胞适应中的关键决定因素（Alasar等2022；Alasar等2024；Gazaloglu等2026；Lavaro等2025）。尽管高通量方法取得了重大进展，但当前核酸甲基化检测方法仍受限于成本、时间、复杂性以及缺乏直接结构敏感性。现有纳米孔测序、核磁共振波谱和冷冻电子显微镜等技术提供了有价值的见解，但它们难以适应快速、常规的甲基化分析[1], [29]。甲基基团（-CH?）是一种常见且简单的烷基片段，由一个碳原子以四面体几何构型与三个氢原子键合而成。由于其非极性特性，甲基基团贡献了疏水性，从而可以改变核酸的物理化学性质、分子相互作用和结构动态。RNA碱基天然不具有甲基基团，但RNA甲基转移酶（MTases）催化的转录后甲基化反应会在特定核苷酸位点引入甲基修饰。例如，m1A（N1-甲基腺苷）是N1位甲基化的腺苷基团，而m?A（N6-甲基腺苷）则是在N6位甲基化。这些修饰可影响RNA的结构、稳定性以及与结合蛋白的相互作用[8], [29]。与RNA碱基相比，脱氧核糖核酸（DNA）碱基胸腺嘧啶在嘧啶环的C5位上具有-CH?基团。这个甲基基团的存在构成了胸腺嘧啶与尿嘧啶之间的根本化学差异，从而贡献了DNA与RNA之间的结构和功能差异。光谱技术因其对分子振动和构象组织的敏感性而提供了一种有吸引力的替代方案。傅里叶变换红外（FTIR）光谱能够检测与甲基基团相关的键特异性振动模式，包括C-H振动[16], [29]。圆二色性（CD）光谱提供手性组织和二级结构的信息[1], [29], [34]。然而，将此类光谱技术应用于核酸甲基化研究的一个关键局限在于缺乏标准化的实验阈值，特别是关于最低浓度要求和光谱分辨率限制。在本研究中，我们通过开发定量的光谱分析来弥补这一空白，评估（i）核酸的浓度依赖性可检测性，（ii）CH?振动特征的分辨率限制，以及（iii）RNA和DNA的结构敏感性。FTIR日益被视为生物分子分析的复兴技术。它已成功用于获取核酸[29], [32], [35]、蛋白[17]、脂质[3], [11]、细胞[26]以及体液[2]的详细信息。实时监测红外光谱特征（如强度、位置和带宽）能够实现对结构变化、分子丰度、分子间相互作用和甲基化状态的快速精确表征。最近，FTIR光谱已发展成为评估DNA或RNA甲基化状态的强大工具[1], [16], [19], [29], [32]。我们小组最近应用FTIR检测RNA甲基化标记，包括合成和细胞RNA中的m?A修饰[30]。其中，FTIR光谱定量区分了甲基化和未甲基化RNA，并检测到了METTL3敲低和TNF-α处理后RNA全局甲基化水平的变化。除了中红外（mid-IR）光谱外，测量左旋和右旋圆偏振光吸收差异的CD光谱为生物大分子的结构和相互作用提供了快速见解[18]。最近，这种方法已成功用于检测不同环境条件下核酸构象动力学的变化，包括甲基化状态[1], [10], [29], [34]。我们小组应用CD光谱评估RNA甲基化（m?A、m1A）如何影响二级结构，并报道甲基化导致CD强度和位置的微小光谱变化，表明碱基堆积和螺旋度发生了改变。METTL3和TRMT61A敲低也改变了CD光谱模式，证明了RNA结构对甲基化的高度敏感性。这证实了CD是一种检测甲基化诱导构象变化的快速敏感方法[30]。本研究旨在确定检测核酸甲基化的定量标准化光谱框架。与证明可行性的以往研究不同，我们超越了定性观察，为FTIR和CD光谱定义了检测阈值、浓度限制和光谱分辨率标准。具体而言，我们研究不同浓度范围下的检测极限，在限定范围内解析CH?振动特征，并比较核酸的结构敏感性，为光谱甲基化分析提供更为严谨、稳健和可重复的基础。现有纳米孔测序、核磁共振波谱和冷冻电子显微镜等技术提供了有价值的信息；然而，它们不能轻易适应快速和常规的甲基化分析[1], [29]。虽然传统检测方法如基于抗体的比色定量试剂盒对特定修饰如m?A具有高特异性，但它们通常需要广泛的样品制备、酶促步骤和消耗大量试剂的工作流程，并且仅限于特定靶标而无法提供结构见解。相比之下，ATR-FTIR和CD光谱提供了一种快速、无需标记且经济高效的替代方案，尽管它们基于不同的分析原理运作。值得注意的是，本文提出的光谱框架旨在作为扫描全局甲基化景观的工具，而不是作为位点特异性分析器。ATR-FTIR无法独立区分总细胞RNA中单个甲基化核苷酸（m?A、m1A和m?C），也无法在缺乏配对对照的情况下排除DNA中胸腺嘧啶固有的甲基贡献。通过从一开始就明确承认这些局限性，本研究将振动光谱定位为高分辨率测序或位点特异性映射技术的补充，而非替代品，作为一种可访问、高通量的全局修饰变化预筛选方法。样本制备称取0.0025 g来自鱼精DNA（Sigma，74782-10G），溶解于1 mL无核酸酶超纯水中（Clear Band，DW05L），配制浓度为2500 ng/μL的储备液。随后用无核酸酶超纯水稀释储备液，获得浓度为2000、1800、1600、1400、1200、900、700、500、300和100 ng/μL的DNA溶液用于FTIR分析。对于CD测量，储备液用10 mM磷酸钠缓冲液稀释浓度依赖性核酸ATR-FTIR特征核酸（RNA、DNA）的中红外光谱模式受其水合状态强烈影响，影响特征振动带的IR峰位置、宽度和强度。采用受控干燥方案已实现通过最小化水干扰更清晰地识别RNA或DNA特异性光谱特征。作为一个代表性示例，图1显示了从MCF10A细胞分离的总RNA在结论本研究提供了使用ATR-FTIR和CD光谱技术表征和定量核酸（DNA和RNA）的实验验证光谱框架。采用受控样品干燥程序，结合FTIR二阶导数光谱分析，实现了对与甲基化相关的CH?伸缩和变形振动的可靠检测，同时保留了核酸固有的振动特征。重要的是，本研究作者贡献G.G.和B.A.构思了实验。B.A.和G.G.设计了实验并解释了结果。G.G.撰写了初稿，所有作者均有所贡献；O.A.进行了所有生物物理实验；B.S.-?和A.A.-A.进行了所有细胞实验。所有作者均已阅读、修订并同意了已发表的稿件版本。未引用参考文献[7], [9], [14], [20], [24]利益冲突声明作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文报告的工作。致谢本工作是O. AKKU?研究生论文的一部分。本研究得到伊兹密尔理工大学科学研究项目拨款支持（AUDP-BAP项目编号：2022IYTE-2-0048，资助B.A.；BAP项目编号：2024IYTE-1-0069，资助G.G.）。Onur Akku? | Buket Sa?lam-?en | Azime Ak?a?z-Alasar | Bünyamin Akgül | Günnur Güler