《Nature Communications》：High-content morphological profiling by Cell Painting in 3D spheroids
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Cell Painting是一种广受欢迎的高内涵成像分析方法，可在规模化条件下捕获2D细胞培养物的形状与内部组织结构。虽然3D细胞培养是具有更高生理相关性、尤其适用于研究药物扰动的模型，但由于光在到达培养物内部前会发生散射，其成像仍具挑战性。研究人员引入了一种
Cell Painting是一种广受欢迎的高内涵成像分析方法，可在规模化条件下捕获2D细胞培养物的形状与内部组织结构。虽然3D细胞培养是具有更高生理相关性、尤其适用于研究药物扰动的模型，但由于光在到达培养物内部前会发生散射，其成像仍具挑战性。研究人员引入了一种可扩展方法，将Cell Painting适配于3D球状体（spheroids）。研究人员表明，组织透明化（tissue-clearing，使球状体透明的技术）联合在成像过程中实时定位球状体的聚焦流程，能够在完整球状体内实现单细胞水平的Cell Painting。通过对52种临床相关药物进行谱分析，研究人员发现，单细胞指纹按生物通路聚类，并且比压扁的球状体整体视图更稳健地解析药物效应。值得注意的是，5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）与olaparib这两种药物在2D单层细胞中几乎不可区分，但在球状体中发生分化；该发现随后经DNA损伤、细胞周期及基因表达实验证实。该流程在标准384孔板格式下运行于转盘共聚焦显微镜（spinning-disk confocal microscope），使已开展Cell Painting的实验室也能进行单细胞3D分析。
研究背景方面，形态学分析（morphological profiling）通过从图像中提取细胞大小、形状和纹理等大量定量特征，为早期药物发现提供机制线索。Cell Painting已成为2D单层培养标准化分析平台，可用于预测作用机制（mechanism of action，MoA）、识别脱靶效应和毒物表型。然而2D培养中细胞与刚性平面相互作用，会形成大黏附斑和应力纤维，不能反映体内3D微环境中的细胞-ECM互作、氧和营养梯度、接触抑制及YAP/TAZ信号状态。3D球状体更具生理相关性，但超过几层细胞后光散射严重，传统方法多把z栈压缩为最大强度投影（maximum intensity projection，MIP），丢失单细胞与腔体信息，难以做单细胞定量形态学谱。因此，研究人员开展本研究，目标是把Cell Painting扩展到完整3D球状体内的单细胞水平，并验证其能否比2D和MIP更稳健地解析药物表型。
该研究发表在《Nature Communications》。研究人员建立并验证了一套适用于3D结直肠癌球状体的Cell Painting流程：用超低附着（ultra-low attachment，ULA）板形成均一球状体，延长染料孵育，采用果糖-甘油组织透明化，转盘共聚焦获取12个光学切面，基于FocusScore的在线球状体检测，Cellpose做细胞核与细胞分割，CellProfiler提取特征，并按光学切面做阴性对照标准化，最后把单细胞特征聚合为孔水平剖面（single-cell aggregated，scAgg）。结论是该流程在现有高内涵平台上即可实现完整球状体内的单细胞形态学谱，单细胞剖面比MIP更能恢复通路结构，且可发现2D下被掩盖的药物差异。
主要关键技术方法包括：ULA板来源HCT116与HT29结直肠癌球状体样本；转盘共聚焦显微镜采集；果糖-甘油水溶液组织透明化；基于FocusScore突变的在线球状体XYZ定位；Cellpose深度学习分割；CellProfiler提取逾2000个形态学特征；按同深度阴性对照做per-section标准化；scAgg与MIP两种特征汇总策略；UMAP与层次聚类做药物相似性分析；跨站点用Nikon与Yokogawa显微镜及空气/水浸物镜验证；并以EdU、γH2AX免疫染色和bulk RNA-seq做分子印证。
研究结果如下。A cell painting workflow for 3D spheroids：研究人员通过ULA成球、长时染孵、果糖-甘油透明化和聚焦驱动检测，获得清晰穿透的球状体图像；Cellpose在各切面分割出大量细胞对象，去重后每球约330至400个细胞；per-section标准化消除深度依赖的强度与表型偏移，从而实现完整球状体内单细胞剖面。
Single-cell level profiling captures phenotypic changes with greater resolution compared to spheroid-wide profiling (MIP)：研究人员并行提取MIP与scAgg特征，grit评分显示两者都能检出药物表型改变，但复制间Pearson相关显示scAgg随浓度升高更稳健，且不同细胞系、剂量和通路下scAgg分辨力均优于MIP，说明单细胞聚合特征保留更多可区分信息。
Single-cell morphological profiles facilitate the detection of biologically relevant clusters：研究人员对HCT116与HT29做半监督与无监督UMAP及余弦相似层次聚类；scAgg的ARI和NMI高于MIP，CDK4/6抑制剂abemaciclib与palbociclib表型高度相似，激酶抑制簇与DNA损伤簇可被分开，表明scAgg恢复MoA对齐的生物结构。
3D Cell Painting is robust to protocol variation and transferable across sites：研究人员变动z步长、密度、透明液浓度、放大倍率，并在AstraZeneca用Yokogawa显微镜复现；12切面子集、30×与10×、低浓度甘油果糖配方均稳定，40×与大球失败；水浸物镜更深更锐但检出球少，证明流程对多数协议变异鲁棒且可跨平台转移。
Morphological profiles reveal different responses to DNA-damage-response compounds in spheroids versus adherent cells：研究人员用同一52药板比较2D贴壁与3D球状体，2D中DNA损伤药散开，3D中聚成一簇；5-FU与olaparib在2D形态相似、在3D明显分离，且该分离只在scAgg中出现，说明3D单细胞形态学能捕捉超出代谢活力的格式特异性药物响应。
Molecular profiling confirms different responses to DNA-damage-response agents in spheroids：研究人员用γH2AX、EdU和bulk RNA-seq印证，olaparib致更多γH2AX灶，5-FU更强抑制EdU入核并诱导p53/p21程序；在TP53野生型HCT116中5-FU与MDM2抑制剂、SN-38聚簇，在TP53突变型HT29中MDM2抑制剂失效而5-FU仍归抗代谢类，证明3D形态簇反映p53依赖与非依赖成分。
讨论部分总结：研究人员指出，单细胞3D球状体形态学谱恢复了MIP与2D都未捕获的药物间生物关系；5-FU与olaparib在2D近一致、在3D分明，并被EdU、γH2AX和RNA-seq独立证实。5-FU经核仁应激稳定p53并强激活p21，olaparib经复制应激与DNA损伤起作用；由于3D环境重塑AKT–mTOR–S6K、YAP/TAZ等信号，药物应力被加工为不同p53/p21表型。该方法保留高内涵筛选基础设施兼容性，为生理相关模型中的单细胞影像表型发现提供框架。
结论部分翻译：完整3D球状体的单细胞形态学剖面恢复了药物间的生物学关系，而球状体整体投影与2D剖面均未能捕获这些关系。olaparib与5-FU在2D形态上几乎相同，却在3D中产生明显分离的剖面；研究人员通过EdU、γH2AX和bulk RNA-seq独立证实了该分化。这些结果之所以可能，是因为研究人员在筛选规模上将Cell Painting适配到3D球状体，同时保留与现有高内涵筛选基础设施的兼容性。5-FU比olaparib更强激活p53/p21程序，却造成更少DNA损伤，并以p53相关方式与前文MDM2抑制剂聚在一起；这种解离与两药通过不同机制调动p53一致：5-FU经核仁应激翻译后稳定p53，olaparib经复制叉加速与DNA损伤。穿透或分区效应不太可能，因为细胞内可检olaparib、球状体较小且仍增殖。由于3D本身重塑 intracellular signaling，研究人员提出该分化反映3D格式改变了每种药物特有DNA损伤、复制应激和核仁应激被加工为p53/p21表型的方式。
