多靶点 ASO 联合疗法逆转 TDP-43 缺失诱导的神经元剪接异常与功能障碍

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：From cryptic exons to neuronal dysfunction: combinatorial antisense makes sense in TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43) pathology

　　

在最近发表于《Science Translational Medicine》的一项研究中，郭等人进一步阐明了TDP-43的病理机制，他们发现当TDP-43缺失时，参与突触功能和膜兴奋性的多个转录本会发生异常剪接。同时使用针对这些转录本的反义寡核苷酸治疗可以纠正剪接异常并恢复神经元功能，这表明联合疗法可能是治疗TDP-43蛋白疾病的有希望的方法

TDP-43是一种RNA结合蛋白，参与mRNA剪接的关键过程，特别是抑制可能导致移码和提前终止密码子的隐性外显子。虽然在生理情况下TDP-43定位于细胞核内，但在几乎所有肌萎缩侧索硬化症（ALS）病例（最常见的运动神经元疾病）以及大约一半的额颞叶痴呆（FTD）病例中，TDP-43会在细胞质中聚集，从而导致其功能丧失。因此，TDP-43的病理变化被认为是多种致病机制共同作用的共同下游结果。但是，真正驱动神经退化的究竟是哪些异常剪接事件呢？在TDP-43作用的6000多个转录本中，究竟哪些事件起到了关键作用？先前的研究表明，与FTD/MND相关的UNC13A基因多态性与TDP-43结合位点重叠，而在TDP-43缺失时，这些多态性会增加隐性外显子包含的概率^{, 。由于UNC13A蛋白参与突触小泡的成熟和神经递质的释放，这些发现建立了神经退化、TDP-43病理变化与突触功能障碍之间的直接机制联系。}

基于这项研究，郭及其同事进一步探究了TDP-43的作用下游机制，以识别更多参与突触功能和膜兴奋性的目标。利用之前来自FTD/MND患者的转录组数据，研究者重点关注了10个额外的转录本（AKT3、CACNA1E、CEP290、KALRN、KCNQ2、MNAT1、RAP1GAP、SETD5、STXBP5L和SYT7），这些转录本在突触功能和/或膜兴奋性中发挥作用，此外还包括之前已经确定的UNC13A和STMN2（另一个已知的高表达TDP-43的靶点）。通过检测人类诱导神经元中TDP-43敲低后这些转录本的隐性剪接改变，以及识别含有TDP-43结合位点和/或TDP-43识别到的GU富集基序的隐性剪接区域，证实了它们确实是TDP-43的靶点。此外，在TDP-43在细胞核中缺失的FTD/MND患者的神经元中，发现这些转录本（KALRN、KCNQ2、RAP1GAP、SETD5和SYT7）中存在隐性外显子的包含现象，而在TDP-43定位正常的邻近神经元中则未见这种现象。研究者进一步证明，敲低其中一些转录本（模拟TDP-43缺失时的表达下降）足以改变神经元的自发放电、兴奋性和/或网络连接性。最后，他们设计了反义寡核苷酸（ASOs）来抑制KALRN、RAP1GAP、SYT7和UNC13A中的隐性外显子包含，并观察到联合使用所有ASO可以完全恢复TDP-43缺失引起的神经元功能障碍，包括自发放电、兴奋性和网络连接性。图1展示了这些发现的总结。

图1

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图1展示了健康神经元中TDP-43介导的剪接调控机制，以及额颞叶痴呆/运动神经元疾病（FTD/MND）中TDP-43在细胞核中缺失的分子和电生理后果。在表现出TDP-43病理变化的神经元中，参与突触功能和膜兴奋性的多个TDP-43靶转录本的正确剪接受到损害，最终导致神经元功能障碍。这些现象可以通过（组合）反义寡核苷酸（ASO）治疗得到纠正。神经元插图改编自Servier Medical Art（https://smart.servier.com），采用CC BY 4.0许可协议（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）

总体而言，这项研究进一步巩固了TDP-43病理变化、隐性剪接与神经元功能障碍之间的联系，并提供了对该过程背后机制的更细致理解。这并非单一途径的破坏导致神经元功能障碍，而是多种机制共同作用的结果，包括离子通道活性的改变、神经元突起的缺陷以及突触小泡成熟的障碍。与此一致的是，没有任何一种ASO单独使用就能完全恢复神经元功能至正常水平。值得注意的是，某些转录本的ASO校正（尤其是KALRN）在电生理参数（放电率、爆发次数、网络爆发）方面带来了更为显著的改善，这表明特定蛋白或途径可能仍具有不成比例的影响。尤其值得注意的是，尽管KALRN的蛋白质水平仅得到适度恢复。

另一个需要指出的是，并非所有的隐性剪接事件都会导致提前翻译终止和无义密码子的产生。例如KCNQ2的情况就是这样，这表明功能的毒性增强也可能导致神经元功能障碍。同样，最近的研究表明，PKN1中TDP-43调控的隐性外显子的解除抑制会产生具有神经毒性的截短蛋白^{。因此，敲低TDP-43的隐性剪接靶点可能无法完全再现TDP-43缺失的生物学和电生理后果。}

一个亟待解决的问题是，这里研究的异常剪接所导致的神经元功能障碍在多大程度上引发了神经退化。虽然敲低某些TDP-43的隐性剪接靶点对细胞存活没有显著影响，但在出现电生理异常后，敲低其他靶点会导致神经元丢失。神经元丢失是否是神经元功能障碍的直接后果？如果是这样，这是否也是一个需要多种新发现的TDP-43靶点共同作用的多因素过程？特别是，如果ASO介导的隐性外显子包含抑制不仅能够纠正电生理异常，还能恢复神经元丢失，那么这是否也需要同时恢复多个TDP-43靶点的表达。

基于在脊髓性肌萎缩症（SMA）中ASO治疗的成功经验，多种基于ASO的疗法已被应用于ALS治疗，效果不一。目前，ASO介导的突变RNA降解已被FDA和EMA批准用于治疗与SOD1突变相关的ALS，同时也在检测用于与FUS突变相关的ALS，这两种ALS类型的特点是缺乏TDP-43包含。相比之下，旨在降低携带ALS致病六核苷酸重复序列患者中C9ORF72水平的ASO策略在一期临床试验后显示出了负面影响，这表明这些病例的病理生理机制更为复杂。尽管具有前景，但针对特定突变的ASO仅适用于少数ALS患者，而TDP-43病理变化更为普遍，涵盖了大多数遗传决定性和几乎所有散发病例。尽管目前正在评估旨在逆转STMN2和UNC13A mRNA中隐性外显子包含的剪接切换ASO，但郭等人的研究表明，更广泛的剪接调节方法或针对多个异常剪接mRNA的组合ASO治疗可能才是逆转TDP-43缺失病理后果的关键。这些结果为未来的治疗尝试提供了重要的原理证明。