WEE1通过拮抗APC/CCDH1活性促进S期进入并塑造WEE1抑制剂敏感性

《Nature》：WEE1 opposes APC/CCDH1 activity to promote S phase entry

　　

WEE1通过磷酸化并抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）活性，阻止有丝分裂进入并建立G₂ DNA损伤检查点。因此，研究人员开发了WEE1抑制剂，用于在依赖该WEE1介导检查点的TP53突变肿瘤中实现合成致死，此类抑制剂正在进行临床试验。然而，WEE1抑制剂在TP53野生型肿瘤中亦具疗效，且许多试验因高水平毒性副作用而终止，提示WEE1具有未知功能。本研究表明，WEE1通过拮抗与CDH1结合的E3泛素连接酶后期促进复合物–细胞周期体（anaphase-promoting complex–cyclosome bound to CDH1，APC/C^CDH1）的活性，促进细胞从静止期（G₀）再进入细胞周期。WEE1在介导CDH1与APC/C相互作用的关键残基上磷酸化CDH1（FZR1）。在G₀/G₁期WEE1功能缺失的细胞中，S期进入延迟、G₁/S转换受损、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21^Cip1/Kip1在S期异常积累，并出现p21依赖性G₂期阻滞。降低APC/C^CDH1或p21表达使细胞对急性WEE1抑制更敏感，且这两条通路在获得性WEE1抑制剂耐药细胞中均下调。这些结果揭示了一种细胞周期控制机制，对WEE1抑制剂在临床中的使用方式具有启示。

研究背景：CDKs（细胞周期蛋白依赖性激酶）控制真核细胞周期进程。WEE1是一种酪氨酸激酶，可通过磷酸化CDK1的Tyr15抑制CDK1，从而阻止有丝分裂进入并形成G₂ DNA损伤检查点；该检查点在TP53突变肿瘤细胞中尤为重要。基于此，WEE1抑制剂（WEE1i）被设计用于TP53突变肿瘤的合成致死治疗并进入临床试验；但WEE1i在TP53野生型肿瘤中亦有疗效，且因来源不明的毒性副作用导致部分试验暂停。既往研究提示WEE1可抑制CDK2，但WEE1对CDK2的直接细胞证据不足，且外源性WEE1表达在IMR90人成纤维细胞中对G₁/S时相无明显影响。因此，研究人员旨在阐明WEE1在早期细胞周期控制中的功能。该研究发表于《Nature》，发现WEE1通过拮抗APC/C^CDH1（与CDH1结合的后期促进复合物–细胞周期体）活性促进细胞从G₀再进入S期，并将CDH1（FZR1）鉴定为WEE1底物；其意义在于揭示了一种细胞周期控制机制，并对WEE1i的临床使用和敏感性标志物选择具有启示。

关键方法：研究人员以CDK4/6抑制剂或接触抑制同步G₀/G₁，结合活细胞时移成像与单细胞追踪，利用内源性mRuby–PCNA、CDK2活性报告、APC/C^CDH1降解报告及CDC6–mVenus、CDC25A–GFP、p21–GFP等标记评估G₁/S；采用siRNA、AID degron（生长素诱导降解子）、WEE1i（AZD1775/MK-1775）和CDK1i扰动；构建常微分方程模型；进行WEE1–CDH1体外激酶反应与质谱定位酪氨酸位点；在非洲爪蟾卵提取物中开展APC/C结合及cyclin B降解实验；用CRISPR–Cas9敲除p21并行RNA测序。样本来源为hTert-RPE1、KU1919膀胱癌、MCF7乳腺癌、HBLAK非转化膀胱尿路上皮细胞系及非洲爪蟾卵提取物，无患者队列。

研究结果：
WEE1促进高效S期进入：研究人员先构建G₁/S调控网络影响图及常微分方程模型，模型预测WEE1活性降低会加速CDK2活化和S期进入；但在CDK4/6抑制剂或接触抑制同步的hTert-RPE1 mRuby–PCNA细胞中，WEE1i、WEE1 siRNA及WEE1–GFP degron降解均导致G₁延长、S期进入细胞比例下降，与模型预测相反，表明WEE1为细胞从静止状态及时进入S期所必需。

WEE1将CDK2活性与G₁/S偶联：通过CDK2L–GFP和DHB–mCherry报告，研究人员发现WEE1i处理后CDK2活性在G₁更早升高且峰值更高；但mCherry–geminin报告显示APC/C^CDH1失活相对于G₁/S的时相和速率与对照相似。CDC6–mVenus和染色质结合MCM7分析显示WEE1i处理缩短复制起点许可窗口并减少MCM7装载。结论是，高CDK2活性不足以加速S期进入，APC/C^CDH1失活对确定S期进入时相比达到CDK2活性阈值更重要，提示WEE1在G₁尚有其他作用。

WEE1i处理细胞S期进入异常：通过mRuby–PCNA成像，研究人员观察到WEE1i处理细胞S期起始PCNA强度低、焦点不清晰，PCNA强度标准差降低并贯穿S期；PIP–mVenus降解减慢；内源性p21–GFP在S期异常积累，联合CDK1i可阻止该积累；γH2Ax升高提示DNA损伤增加；p21敲除实验表明WEE1i诱导的G₂/G₂样阻滞依赖p21，而G₁阻滞不依赖p21；DNA含量分析显示WEE1i处理细胞在2n–4n间积累。结论是WEE1i导致异常G₁/S转换和S期进程，p21异常积累可能参与DNA损伤及G₂样阻滞。

WEE1抑制APC/C^CDH1以促进G₁/S：研究人员修订模型并比较三种假设，利用CDC6–mVenus和CDC25A–GFP发现WEE1i后G₁期APC/C^CDH1活性增加，支持WEE1独立于CDK2抑制CDH1的模型；CDH1敲低或EMI1诱导抑制APC/C^CDH1可缩短G₁并减少G₀/G₁阻滞；CDH1蛋白稳定性未变；体外激酶实验和质谱显示WEE1磷酸化CDH1的Tyr91和Tyr130；结构分析提示Tyr91与APC1 His1231形成氢键、Tyr130稳定C-box；磷酸模拟突变Y91E/Y130E降低CDH1与APC/C结合，双突变几乎完全缺陷并严重损害cyclin B降解。结论是WEE1通过磷酸化CDH1 Tyr91/Tyr130减弱CDH1与APC/C结合，从而抑制APC/C^CDH1活性。

对WEE1i敏感性的影响：在TP53野生型KU1919膀胱癌和MCF7乳腺癌细胞中，研究人员重现WEE1i诱导的G₁延长及G₁、G₂阻滞；p21敲除细胞在WEE1i处理时G₂期死亡增加并更敏感；非转化HBLAK膀胱尿路上皮细胞中p21敲除亦增强WEE1i敏感性；CDH1 siRNA增加hTert-RPE1对WEE1i的敏感性；WEE1i耐药MCF7细胞的RNA测序显示核苷酸生物合成通路上调、TP53、CDKN1A、ANAPC7和ANAPC10下调；急性p21或CDH1缺失增敏，而慢性耐药细胞下调p53–p21和APC/C^CDH1通路；DepMap分析显示多个APC/C^CDH1组分与WEE1缺失协同。结论是CDKN1A状态和APC/C^CDH1通路活性可能作为WEE1i敏感性标志。

讨论部分总结：临床试验中WEE1i相关骨髓抑制、胃肠道反应和疲劳等副作用曾被归因于PLK1脱靶，但WEE1的其他功能亦可能解释部分毒性。研究人员提出WEE1在静止细胞再进入周期中发挥作用，可能影响健康组织。WEE1一方面抑制CDK2以阻止S期进入，另一方面抑制APC/C^CDH1以促进S期进入，整体上促进S期进入；其机制可能包括通过抑制APC/C^CDH1使CDC25A积累，从而逆转WEE1对CDK2的抑制性磷酸化，且WEE1可能需要在CDK2介导CDH1磷酸化之前初始抑制APC/C^CDH1。未来通过突变WEE1和CDK磷酸位点、鉴定CDH1酪氨酸磷酸酶，可确定各通路相对重要性。mTOR磷酸化CDH1 Thr129可短暂失活APC/C^CDH1，该位点邻近WEE1靶向的Tyr130，提示该基序在调控APC/C^CDH1中可能重要；APC/C^CDH1可能作为G₁信号整合器决定细胞是否承诺增殖。模型与实验尚存差异：模型预测S期后CDC25A升高，但细胞中CDC25A可被CHK1磷酸化降解；模型预测极低WEE1活性下G₀/G₁阻滞伴随高CDK2活性和Rb抑制，但实验中未观察到，原因可能与CAK活性降低有关。WEE1i原为TP53突变合成致死设计，却在TP53野生型肿瘤中有效，因此需明确敏感性参数；p21和APC/C^CDH1组分可能是敏感性指标，急性丢失p21或CDH1增敏，而耐药细胞下调p53–p21和APC/C^CDH1可能反映慢性药物暴露适应。CDKN1A状态和APC/C^CDH1通路活性值得进一步研究作为WEE1i治疗生物标志物，包括CDKN1A突变膀胱癌；WEE1i毒性可能至少部分源于静息干细胞中APC/C^CDH1活性增加，损害其再进入增殖和维持组织功能。

研究结论翻译：总之，研究数据提示，CDKN1A突变状态或APC/C^CDH1亚基表达可用于改善患者选择，并可能降低WEE1i临床试验中的毒性。