CD51标记的星形胶质细胞亚群在神经环路中的功能分化与突触调控机制研究

《Nature》：CD51 delineates functionally distinct astrocyte subtypes in neural circuits

　　

星形胶质细胞执行多种促进脑生理功能的任务，这提示这些多样的星形胶质细胞功能可能由功能上不同的亚群所实现。近期研究鉴定了星形胶质细胞间的分子多样性；然而，这种分子异质性是否反映了具有不同功能的特化星形胶质细胞亚群仍不清楚。在此，基于既往分子与功能研究，研究人员构建了CD51-FLP小鼠品系，该品系能够在体内神经环路中直接比较CD51+与CD51?星形胶质细胞亚群的功能特性。研究人员发现，CD51+与CD51?星形胶质细胞在皮层和海马中均具有独特的形态学、生理学及发育学特性。功能研究表明，CD51+星形胶质细胞在发育期皮层中选择性促进突触形成，并在海马中介导环路可塑性。在机制层面，研究人员发现CD51+星形胶质细胞通过磷脂酰肌醇蛋白聚糖6（glypican 6）促进皮层突触形成，而CD51本身则驱动海马环路可塑性。将这些发现应用于脑损伤研究，研究人员发现CD51+星形胶质细胞通过增强突触重塑促进卒中后功能恢复。综上所述，该研究鉴定了在发育期、成熟期及损伤后脑中表现出不同功能特性的特化星形胶质细胞亚群。

论文解读：CD51标记的星形胶质细胞亚群在神经环路中的功能分化与突触调控机制

研究背景与科学问题

星形胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system, CNS）中数量最丰富的胶质细胞类型，在神经传递、突触形成、环路功能、代谢支持、血脑屏障维持以及损伤与退行性病变反应等脑生理的各个方面均发挥重要作用。细胞多样性是器官系统运行的必要条件，不同类型细胞通过分工协作完成基本生理活动。近年来，单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术的进步使研究者能够鉴定出多个潜在的星形胶质细胞亚群，提示这些多样化的功能可能由不同的星形胶质细胞亚群分工执行。然而，分子异质性是否真正反映具有不同功能的特化星形胶质细胞亚群，这一问题始终悬而未决。既往研究虽然鉴定了表达独特标志物的星形胶质细胞群体，并证明了特定基因在星形胶质细胞中的作用，但未能直接比较不同亚群之间的功能特性。在细胞水平明确证明功能不同的星形胶质细胞亚群，需要在体内直接比较两个群体之间的功能特性。然而，能够选择性标记和操控特定星形胶质细胞亚群的工具此前并不存在。因此，神经环路中是否存在功能不同的星形胶质细胞亚型这一问题长期未获解答。本研究旨在开发能够选择性靶向星形胶质细胞亚群的工具，并直接比较不同亚群的功能特性。

研究内容与主要结论

研究人员构建了CD51-FLP小鼠品系，该品系能够通过FLP-FRT系统选择性标记和操控CD51⁺与CD51^?星形胶质细胞亚群。研究发现，CD51⁺与CD51^?星形胶质细胞在皮层和海马中具有独特的形态学、生理学及发育学特性。在功能层面，CD51⁺星形胶质细胞在发育期皮层中选择性促进突触形成，并通过磷脂酰肌醇蛋白聚糖6（glypican 6, GPC6）发挥作用；在海马中，CD51⁺星形胶质细胞通过CD51本身驱动环路可塑性和记忆功能。在脑损伤背景下，CD51⁺星形胶质细胞通过增强突触重塑促进卒中后功能恢复。该研究发表于《Nature》，首次在细胞水平直接比较了功能不同的星形胶质细胞亚群，为理解星形胶质细胞多样性提供了重要的功能性证据。

关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：构建CD51-FLP细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）转基因小鼠品系，结合Rosa-FSF-tdTomato报告小鼠实现星形胶质细胞亚群的选择性标记；利用FLP依赖的腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）工具实现CD51⁺与CD51^?星形胶质细胞的选择性操控；采用荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）结合RNA测序进行转录组分析；使用双光子成像检测星形胶质细胞钙（Ca²⁺）活性；运用化学遗传学（DREADD）技术实现星形胶质细胞亚群的选择性激活；采用CRISPR-Cas9基因编辑技术实现条件性基因敲除；结合免疫沉淀-质谱（immunoprecipitation-mass spectrometry, IP-MS）鉴定蛋白质相互作用；利用基于荧光共振能量转移（F?rster resonance energy transfer, FRET）的神经元-星形胶质细胞邻近分析（neuron-astrocyte proximity assay, NAPA）检测星形胶质细胞与突触的相互作用；采用光血栓模型诱导皮层缺血性卒中。研究使用8周龄成年小鼠及出生后不同发育时间点（P1-P28）的小鼠。

研究结果

不同的细胞特性

通过FACS分析，研究人员鉴定出CD51（由Itgav基因编码的αV整合素亚基）作为能够划分星形胶质细胞亚群的细胞表面标志物。在8周龄小鼠中，CD51⁺星形胶质细胞约占海马星形胶质细胞的19%、嗅球的13%和皮层的38%。利用Sholl分析发现，皮层CD51⁺星形胶质细胞表现出增强的形态复杂性，而海马CD51⁺星形胶质细胞则表现出相对降低的复杂性。双光子成像检测自发钙活性发现，皮层CD51⁺星形胶质细胞表现出增强的自发钙活性，而海马中CD51^?星形胶质细胞的自发钙活性则高于CD51⁺星形胶质细胞。这些结果表明CD51⁺与CD51^?星形胶质细胞在皮层和海马中具有独特的形态学和生理学特性。

CD51⁺与CD51^?星形胶质细胞的产生

利用EdU标记和细胞周期标志物（Ki-67和磷酸化组蛋白H3）染色，研究人员发现CD51^?星形胶质细胞在P1时高度增殖，而CD51⁺星形胶质细胞在P7-21期间表现出增强的增殖能力。CD51⁺星形胶质细胞的比例在P1至P21期间稳步增加，在P21时达到约40%的峰值。发育转录组数据分析显示Itgav在出生后星形胶质细胞谱系中开始表达。在E16.5时，脑室/脑室下区的SOX2⁺前体细胞不表达CD51，但P1时部分前体细胞呈tdTomato阳性。研究人员在Itgav上游调控区鉴定了胶质发育转录因子核因子I-A（nuclear factor I-A, NFIA）的结合基序。利用Aldh1l1-creER;NFIA-flox;Rosa-LSL-tdTomato小鼠进行条件性敲除Nfia后，皮层CD51⁺星形胶质细胞比例显著降低，表明NFIA调控CD51⁺星形胶质细胞的发育。神经元活性刺激实验表明，CD51⁺与CD51^?星形胶质细胞的比例不受神经元活性影响，提示其产生主要依赖细胞内在的遗传程序。

独特的分子特征

通过将CD51-FLP;Rosa-FSF-tdTomato品系与Aldh1l1-GFP品系杂交，研究人员利用FACS分离皮层和海马中的CD51⁺（GFP⁺tdTomato⁺）和CD51^?（GFP⁺tdTomato^?）星形胶质细胞并进行RNA-seq分析。转录组分析显示两个群体具有独特的分子特征。基因本体（Gene Ontology, GO）分析显示，皮层CD51⁺星形胶质细胞富集了与突触功能、突触组装和神经元相互作用相关的基因。已知突触形成基因分析显示，磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族成员在CD51⁺星形胶质细胞中表达富集。

皮层突触形成的促进

利用FLP依赖的AAV工具，研究人员实现了hM3Dq在CD51⁺或CD51^?星形胶质细胞中的选择性表达。在P0-2注射AAV，P7-21期间给予CNO（或生理盐水对照），P21收集组织。免疫染色和电生理记录显示，CD51⁺星形胶质细胞的化学遗传学激活显著促进了兴奋性和抑制性突触的形成，而CD51^?星形胶质细胞的激活未产生显著效果。突触电流频率增加而幅度不变，与突触数量增加一致。神经元数量和分层未受星形胶质细胞刺激的影响。机制研究表明，GPC6蛋白在CD51⁺星形胶质细胞中富集表达。利用CRISPR-Cas9系统在CD51⁺星形胶质细胞中敲除Gpc6后，hM3Dq诱导的兴奋性突触形成增加被消除；而Gpc6过表达则足以增加突触数量。RNA-seq分析提示G_q刺激可能促进GPC6向星形胶质细胞末梢的递送。

记忆增强

在成年海马中，研究人员利用相同的条件性AAV工具实现CD51⁺或CD51^?星形胶质细胞中hM3Dq的选择性表达。海马中约80-85%的星形胶质细胞为CD51^?，约15-20%为CD51⁺。全星形胶质细胞、CD51⁺和CD51^?星形胶质细胞刺激均能诱导长时程增强（long-term potentiation, LTP）和记忆增强。由于CD51⁺星形胶质细胞在海马中的代表性低4-6倍却产生相同的增强效果，研究人员通过1:50稀释病毒将CD51^?星形胶质细胞的表达限制在约15-20%以匹配CD51⁺的比例。结果显示，刺激约20%的CD51^?星形胶质细胞无法在阈下刺激水平诱导LTP或增强记忆表现，而CD51⁺星形胶质细胞刺激则能诱导LTP和增强记忆。基础突触活性分析显示CD51⁺星形胶质细胞刺激促进突触活性，而CD51^?星形胶质细胞刺激无此效果。配对脉冲比无差异，表明CD51⁺星形胶质细胞刺激增强了突触输入和连接性。

海马环路功能的调控

研究人员利用CRISPR-Cas9系统在海马星形胶质细胞中条件性敲除Itgav。theta-burst刺激诱导LTP的实验显示，星形胶质细胞Itgav敲除导致增强作用的丧失，并伴随CA1神经元基础突触活性的显著降低。行为学实验显示Itgav敲除小鼠在记忆表现中表现出显著缺陷。相反，利用AAV系统在海马星形胶质细胞中过表达HA标记的CD51后，阈下刺激（40 Hz, 10脉冲）即可诱导LTP，突触活性增加，空间记忆和恐惧记忆行为均增强。免疫沉淀-质谱分析鉴定了海马特异的CD51相互作用蛋白，包括NMDA受体（GRIN1）、GABA转运体（SLC32A1）、Na⁺/K⁺通道（HCN1）和SLC16A7（MCT2），这些相互作用与CD51调节海马环路功能的作用一致。

卒中恢复的促进

在皮层光血栓缺血性卒中模型中，研究人员发现梗死周围CD51⁺星形胶质细胞在卒中后7天和21天表现出增强的形态复杂性，并在损伤边界积累。EdU标记实验显示CD51⁺星形胶质细胞在梗死边界表现出更高的增殖率。NAPA实验显示，梗死周围CD51⁺星形胶质细胞与突触的FRET信号显著高于CD51^?星形胶质细胞，表明CD51⁺星形胶质细胞与突触的相互作用更紧密。在卒中后7-21天期间对CD51⁺星形胶质细胞进行hM3Dq-CNO化学遗传学刺激后，网格行走实验显示运动功能恢复显著增强，且兴奋性和抑制性突触数量增加。各组的病变体积无差异，血管密度、神经元数量、GFAP和IBA1免疫反应性均无差异，表明功能恢复源于增强的突触重塑。

讨论与结论

星形胶质细胞多样性的本质因缺乏靶向特定亚群的工具和明确的功能基准而长期难以阐明。本研究中，研究人员构建了能够选择性靶向和操控CD51⁺与CD51^?星形胶质细胞亚群的小鼠品系和病毒工具，发现CD51⁺星形胶质细胞在功能上区别于CD51^?星形胶质细胞，具有支持发育期和损伤后皮层突触形成以及海马记忆环路功能的特化功能。直接比较细胞亚群之间的功能特性对于操作性地定义不同亚群至关重要。与神经元多样性不同，星形胶质细胞多样性的定义并不明确。研究发现星形胶质细胞亚群表现出分级的功能特性，CD51⁺星形胶质细胞在正常和病理条件下更有效地促进与功能神经环路的相互作用，提示其特化功能可能由与神经元的相互作用驱动，其他功能不同的星形胶质细胞亚群可能源于与血管或免疫群体的相互作用。CD51⁺星形胶质细胞在出生后皮层促进突触形成，部分通过GPC6的升高表达实现，并具有独特的增殖特性，表明这些功能特性在发育早期即被指定。CD51⁺群体在P1左右出现于脑室/脑室下区，其产生与内在转录因子程序相关，提示其代表具有不同功能特性的指定星形胶质细胞亚型。研究结论表明，CD51⁺星形胶质细胞在发育期皮层通过GPC6促进突触形成，在海马中通过CD51驱动环路可塑性和记忆功能，并通过增强突触重塑促进卒中后功能恢复，其独特的突触形成特性在出生后发育和脑损伤修复中保守存在。