安第斯病毒（ANDV）刺突蛋白识别原钙黏蛋白-1（PCDH1）的结构基础及中和抗体阻断受体结合的双重机制

《Nature》：Structural basis for protocadherin-1 recognition by New World hantaviruses

　　

汉坦病毒是啮齿动物传播的病原体，可导致严重人类疾病，目前尚无获批治疗药物。包括安第斯病毒（Andes virus, ANDV）在内的新世界汉坦病毒利用细胞表面受体原钙黏蛋白-1（protocadherin-1, PCDH1）进入宿主细胞。然而，该相互作用的结构基础仍不清楚。本文中，研究人员以近原子分辨率描述了PCDH1与ANDV刺突蛋白结合的结构。PCDH1不对称地结合由刺突蛋白中四个Gn原聚体形成的深中央口袋，这解释了为何仅完整病毒颗粒或可溶性四聚体能够识别该受体。诱变研究鉴定了塑造受体结合位点并实现PCDH1结合从新世界向旧世界糖蛋白转移的三个Gn环。对四种中和抗体的结构与功能分析显示，它们通过两种不同机制阻断受体结合——遮蔽进入PCDH1结合位点的通道，或通过空间位阻阻止受体结合。总之，这些发现定义了汉坦病毒-受体识别的结构决定因素，揭示病毒如何通过将受体结合位点凹陷于表面凹处来掩蔽该位点，以及抗体如何反制这一策略，并为设计靶向汉坦病毒刺突蛋白的抗病毒治疗药物提供框架。

汉坦病毒（hantaviruses）为啮齿动物传播病原，可致严重人兽共患病。新世界汉坦病毒（New World hantaviruses, NWHs）中的安第斯病毒（Andes virus, ANDV）和辛诺柏病毒（Sin Nombre virus, SNV）分别在南美洲和北美洲引起汉坦病毒心肺综合征（hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS），病死率可接近40%；旧世界汉坦病毒（Old World hantaviruses, OWHs）如汉滩病毒（Hantaan virus, HTNV）等亦与严重疾病和死亡相关。ANDV还具有人际传播能力，且目前无美国食品药品监督管理局或欧洲药品管理局批准的防治药物。PCDH1是ANDV入胞所需受体，表达于人气道上皮和内皮细胞，含七个胞外钙黏蛋白重复（extracellular cadherin-repeat, EC）结构域；既往研究显示PCDH1只识别病毒颗粒或可溶性四聚体刺突，而不识别可溶性GnH–Gc异二聚体，且EC1结构域为关键，但其结构基础不明。该研究发表于《Nature》。

研究人员采用ANDV Chile-9717869株Gn/Gc与人PCDH1 EC1–4共表达并纯化可溶性刺突四聚体，利用冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）解析复合物结构；以酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和生物层干涉术（biolayer interferometry, BLI）验证结合，并以病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）冷冻电镜验证；构建表达ANDV、HTNV及嵌合糖蛋白的重组水疱性口炎病毒（recombinant vesicular stomatitis virus, rVSV）进行结合与感染抑制实验；建立基于Semliki森林病毒（Semliki Forest virus, SFV）复制子的SHV深度突变扫描（deep mutational scanning, DMS）文库；制备四种人中和抗体的免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）和单链可变片段（single-chain variable fragment, scFv），行竞争ELISA和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）感染抑制，并解析MIB22–GnH晶体结构。样本来源包括ANDV Chile-9717869株、人PCDH1及HUVEC等。

研究结果如下。PCDH1稳定(Gn–Gc)₄刺突蛋白：研究人员设计异源八聚化结构域使Gn和Gc共表达形成可溶性刺突四聚体，ELISA和BLI显示其与PCDH1 EC1–4特异结合；单独可溶性刺突冷冻电镜重建不稳定，与PCDH1 EC1–4共表达共纯化后获得2.4 ?图谱，模型与病毒颗粒上的刺突四聚体高度相似，提示PCDH1稳定受体结合构象。PCDH1结合刺突中央口袋：采用掩膜三维分类和非均匀精修结合伪C₄对称处理获得2.6 ?复合物图谱，PCDH1 EC1插入四个Gn原聚体形成的深中央口袋，与两个相邻原聚体接触较多、与另两个接触较少，解释其只结合完整颗粒或四聚体而不结合可溶性GnH–Gc异二聚体；VLP冷冻电镜在3.9 ?整体分辨率下显示中央额外密度；rVSV-ANDV可被PCDH1 EC1捕获，而rVSV-HTNV及替换GnH CD环或CD/AB/DE三环的嵌合体不能；DMS显示GnH CD和AB环及邻近区域存在强选择信号，GnB DE环保守。受体利用的结构基础：序列和结构比较显示OWH在GnH AB环和GnB DE环存在预测与PCDH1冲突的替换，GnH CD环在NWHs中伸展、在OWHs中呈紧凑螺旋；rVSV嵌合体结合和sEC1–2感染抑制实验显示，替换受体结合环可改变ANDV/SNV受体结合与感染抑制敏感性，HTNV需同时替换三个受体结合环才能较弱结合PCDH1，表明腔周环序列决定NWHs与OWHs的受体嗜性差异。ANDV中和的机制基础：PCDH1口袋尺寸不容纳常规抗原结合片段（antigen-binding fragment, Fab）；MIB22–GnH晶体结构分辨率3.1 ?显示其表位邻近CD环；结构建模、竞争ELISA和HUVEC感染抑制显示，ADI-65534和ANDV-34不直接遮蔽口袋，其scFv不阻断而IgG阻断，提示通过抗体恒定区空间位阻阻止受体结合；ANDV-5和MIB22直接遮蔽PCDH1结合位点，IgG和scFv均阻断，且ANDV-5 scFv阻断效率高于MIB22 scFv。

讨论部分指出，PCDH1以膜远端EC1插入完全组装刺突四聚体中央腔，受体结合依赖糖蛋白序列和刺突组织方式；该结合模式解释PCDH1对病毒颗粒/四聚体的偏好，并提示组装后形成的四级表面可作为受体识别基础。与甲病毒属西马脑炎病毒利用原钙黏蛋白-10（PCDH10）相比，二者虽均使用膜远端EC1，但结合模式和界面不同；OWHs等非PCDH1利用汉坦病毒可能使用类似中央口袋的替代受体结合位点，GnH CD环的柔性、变异性和可突变耐受性可能利于受体适应。PCDH1结合位点不涉及融合蛋白Gc，提示受体结合与膜融合可能相对独立，但酸性pH下Gn四聚体构象变化仍可能影响融合激活。中和抗体反应对控制感染重要；凹入的受体结合口袋不利于常规抗体进入，提示延长CDR环的抗体、单域抗体或生物制品可能进入腔底，针对完整刺突中部分埋藏表位的抗体也可能阻止受体结合位点形成。研究结论可译为：这些发现定义了汉坦病毒-受体识别的结构决定因素，揭示病毒如何通过将受体结合位点凹陷于表面凹处来掩蔽该位点以及抗体如何反制这一策略，并为设计靶向汉坦病毒刺突蛋白的抗病毒治疗药物提供框架。