BKCa通道激活增加线粒体超复合体并改善心脏停搏液停搏与体外循环后心肌顿抑大型动物模型的心脏恢复

《Antioxidants》：BKCa Channel Activation Increases Mitochondrial Supercomplexes and Improves Cardiac Recovery in a Large Animal Model of Myocardial Stunning Following Cardioplegic Arrest and Cardiopulmonary Bypass

摘要：采用心脏停搏液停搏与体外循环（cardioplegic arrest and cardiopulmonary bypass，CP/CPB）的心脏手术或移植使心脏遭受轻度可逆性缺血损伤，并导致显著心肌顿抑（myocardial stunning）。心肌细胞线粒体大电导钙激活K⁺通道（mitochondrial large conductance calcium-activated K⁺ channels，BK_Ca）具有强效心脏保护作用，并在缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤后有益调节呼吸和活性氧（reactive oxygen species，ROS）。然而，BK_Ca依赖性K⁺流如何调节ROS和呼吸尚不清楚。研究人员在临床前大型动物猪CP/CPB心肌顿抑模型中评估了BK_Ca激活剂rottlerin，并在体外和体内评估BK_Ca依赖性心脏保护机制。采用小分子rottlerin激活BK_Ca后，再灌注1 h时左心室（left ventricular，LV）心功能恢复和收缩力显著改善。透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）显示rottlerin组线粒体较大，与K⁺内流一致。研究人员还发现，接受rottlerin治疗的猪电子传递链超复合体（electron transport chain supercomplexes，mSCs）增加，而mSCs被认为可提高呼吸效率并减少ROS。与mSC增加一致，rottlerin减少CP/CPB猪中ROS依赖性蛋白修饰。在补充研究中，rottlerin和/或腺病毒过表达突变型线粒体BK_Ca（mito-BK_Ca）在体外CP/复氧（CP/reoxygenation）后增加呼吸、改变线粒体形态、增加mSC组装并显著减少ROS，与CP/CPB猪相似。总之，mito-BK_Ca激活增加mSCs和呼吸，同时减少ROS，提示mSC依赖性呼吸效率改善促进强效心脏保护。

研究背景与意义：心肌顿抑（myocardial stunning）是存活心肌因可逆性缺血损伤导致收缩功能降低，可引起心输出量和组织灌注下降。整体性心肌顿抑可见于采用心脏停搏液停搏与体外循环（CP/CPB）的心脏手术或心脏移植；区域性心肌顿抑见于急性心肌梗死（myocardial infarction，MI）再血管化、非体外循环冠状动脉旁路移植和经皮冠状动脉介入等。多数患者顿抑可缓解，但约10%的CP/CPB病例严重顿抑可持续存在，需要正性肌力药和/或机械循环支持，延长住院时间、增加死亡风险并加重经济负担，因此需要改进心脏手术停搏和移植中的心脏保护策略。线粒体K⁺通道包括ATP敏感性K⁺通道（K_ATP）、小电导Ca²⁺激活K⁺通道（SK）和大电导Ca²⁺激活K⁺通道（BK_Ca）。与K_ATP和SK通道不同，BK_Ca不存在于心肌细胞肌膜，而仅表达于线粒体内膜（inner mitochondrial membrane，IMM），可减轻心律失常顾虑；心肌细胞表达仅见于IMM的C端“DEC”剪接变体。BK_Ca是线粒体体积的重要调节因子，其激活与ROS产生减少、线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）开放减少、线粒体膜电位（ΔΨ_m）调节和呼吸改善相关。在不可逆I/R损伤啮齿类模型中，BK_Ca激活或过表达与活力改善、梗死面积减小和心功能改善相关；相反，心肌细胞特异性BK_Ca缺失加重I/R损伤。研究人员此前在离体灌流啮齿类心脏心肌顿抑模型中发现，补充BK_Ca激活剂rottlerin的停搏液可改善冷停搏后30 min的心脏恢复；该心脏保护在BK_Ca敲除小鼠中消失。细胞模型显示rottlerin阻断CP诱导的ROS生成并减轻ΔΨ_m下降，提示线粒体功能改善和呼吸保留。尽管K⁺通道激活后线粒体功能改善已被认识，但K⁺流如何改善ROS和调节呼吸的下游机制仍不清楚。研究人员据此提出假设：线粒体K⁺流及随后的线粒体体积调节可能改变线粒体结构，促进和/或保留电子传递链（electron transport chain，ETC）超复合体（mSCs）；mSCs由ETC复合体I、III和IV物理结合形成，被认为可提高线粒体呼吸效率，并与ROS生成减少和氧化损伤减轻相关。

研究人员开展了什么研究、结论及意义：研究人员采用高度转化、临床相关的大型动物猪CP/CPB模型，以含或不含rottlerin的停搏液使心脏停搏，并行体外循环1 h，随后撤机再灌注1 h，评估线粒体大小、超复合体组装和ROS依赖性蛋白修饰；同时在体外CP/复氧（CP/ReO₂）细胞模型中评估rottlerin和/或线粒体特异性BK_Ca过表达对线粒体形态、呼吸和ROS生成的影响。研究结论支持BK_Ca依赖性心脏保护，并提示BK_Ca激活促进mSC组装可能是改善线粒体功能、减少ROS介导心脏保护的中心机制；据原文，这是首次在大型动物心肌顿抑和可逆性缺血模型中证明强效BK_Ca依赖性心脏保护。其意义在于BK_Ca激活可能成为心脏手术或移植相关缺血损伤的强效心脏保护治疗策略。

关键技术方法（不超过250字）：使用约50 kg雄性和雌性Yorkshire猪，设sham、CP/CPB、CP/CPB+rottlerin组；建立低温CP/CPB及冷血停搏液停搏模型，停搏液中给予500 nM rottlerin，再灌注1 h评估血流动力学。采用TEM定量线粒体面积，蓝原生PAGE（BN-PAGE）和免疫印迹检测mSC及ETC复合物，OxyBlot检测ROS依赖性蛋白羰基化。体外采用H9c2细胞CP/ReO₂模型，Seahorse耗氧分析、腺病毒过表达功能获得性线粒体BK_Ca（mBKQ）、线粒体形态定量及线粒体基质靶向HyPer7 ROS传感。

研究结果：（1）Rottlerin改善旁路后心脏收缩力和心功能：CP/CPB猪出现显著心肌顿抑，与sham相比左心室收缩压（LVSP）、左心室发展压（LVDevP）和最大正压导数（+dP/dt）下降约40–50%；500 nM rottlerin显著改善上述功能恢复指标。CP/CPB组最大负压导数（?dP/dt）降低、Tau升高，rottlerin组呈正常化趋势；两组心率均升高。500 nM rottlerin组收缩末弹性（Ees）及Ees/动脉弹性（Ea）比值显著改善，Ea单独无显著变化。CP/CPB后收缩压（SBP）、舒张压（DBP）和平均动脉压（MAP）下降，rottlerin组呈非显著改善趋势；脉压无显著变化但存在趋势。提示停搏液间歇直接给药不引起显著全身血管扩张。（2）Rottlerin增加线粒体大小、促进呼吸超复合体并减少ROS依赖性损伤：TEM显示CP/CPB降低线粒体面积，rottlerin增加线粒体面积，与K⁺内流增加线粒体基质体积一致。BN-PAGE显示CP/CPB显著降低mSC形成，rottlerin使其正常化；复合体I、III、IV的总复合物组装无变化；代表性ETC亚基表达无显著变化，提示该急性心肌顿抑模型无总体线粒体蛋白表达改变。（3）Rottlerin降低CP/CPB后线粒体蛋白氧化：分离线粒体蛋白的OxyBlot显示CP/CPB组ROS依赖性蛋白羰基化呈强趋势增加，CP/CPB+rottlerin组显著改善。（4）Rottlerin增加体外线粒体呼吸：H9c2细胞CP/ReO₂的Seahorse耗氧分析显示CP/ReO₂降低基础呼吸和ATP关联呼吸，rottlerin显著增加；rottlerin增加对照和CP/ReO₂细胞的基础质子漏；CP/CPB显著降低FCCP诱导的最大呼吸，rottlerin增加但不显著；非线粒体耗氧无影响。提示rottlerin改善mSC组装和心功能与基础和ATP关联呼吸增加相关。（5）功能获得性线粒体特异性BK_Ca通道（mBKQ）过表达调节线粒体形态：腺病毒过表达带flag标签、R267Q突变的大鼠BK_Ca-DEC剪接变体（mBKQ）。CP/ReO₂使稳定表达mito-RFP的H9c2细胞纵横比和形状因子降低，mBKQ过表达显著增加两者，与rottlerin对猪LV线粒体的作用一致，支持rottlerin效应经BK_Ca介导。（6）mBKQ在体外CP/ReO₂后增加mSCs：BN-PAGE显示mBKQ增加对照和CP/ReO₂细胞中复合体I、III、IV进入mSC；总复合体III无变化；体外CP/ReO₂未显著降低mSC，与体内猪模型不同，提示体外细胞模型线粒体重构较轻。（7）mBKQ增加CP/ReO₂后线粒体呼吸：CP/ReO₂降低线粒体呼吸；mBKQ显著增加基础呼吸、ATP关联呼吸和质子漏，并增加最大呼吸，后者在rottlerin急性激活中未观察到，可能与48 h过表达和急性激活时程不同有关。（8）BK_Ca过表达减少线粒体ROS：线粒体基质靶向HyPer7比率型ROS传感器显示CP/ReO₂显著增加线粒体ROS，mBKQ显著降低；信号以二硫苏糖醇（DTT）和H₂O₂归一化。

讨论与结论：讨论指出，本研究在临床前大型动物CP/CPB模型中证明rottlerin是强效心脏保护剂，并首次在大动物体内缺血模型评估BK_Ca心脏保护作用；心脏收缩力改善伴随TEM线粒体体积正常化、线粒体蛋白氧化修饰减少和mSC组装显著增加。体外CP/复氧抑制呼吸，rottlerin依赖BK_Ca激活及功能获得性mito-BK_Ca过表达可逆转；BK_Ca过表达可模拟体内rottlerin的多种效应。作者提出促进mSC是BK_Ca依赖性心脏保护的关键机制，可限制ROS并改善呼吸；但精确机制尚不清楚，作者假设K⁺流使线粒体体积正常化，进而需要线粒体结构和膜重塑及嵴形成，可能涉及心磷脂、prohibitins、Opa1和MICOS等，未来需mSC和嵴修饰蛋白的敲除/过表达及mSC组装因子敲低研究。讨论还指出，rottlerin为nM级BK_Ca激活剂（mallotoxin），既往paxilline抑制、BK_Ca敲除无保护及mBKQ模拟支持BK_Ca介导；但rottlerin在μM范围有其他活性，本模型500 nM经停搏液间歇血管内给药并于再灌注移除，不能忽略其他效应。临床转化受限包括治疗窗窄、BK_Ca广泛表达导致全身给药脱靶，未来需靶向基因治疗或线粒体BK_Ca特异性化合物。研究结论（译）：总之，研究人员证明小分子rottlerin激活BK_Ca在心脏停搏液停搏与体外循环相关心肌顿抑大型动物模型中强效改善心脏收缩力；该效应与线粒体体积正常化、线粒体超复合体保留及体内ROS减少相关。rottlerin激活BK_Ca和/或功能获得性线粒体特异性BK_Ca通道过表达均增加呼吸、增加mSC并减少ROS。结果提示BK_Ca激活可能是心脏手术或移植相关缺血损伤的强效心脏保护治疗策略。