基于自纳米乳化给药系统的烯丙孕素口服生物利用度增强与药代动力学研究

《Pharmaceutics》：Enhanced Oral Bioavailability and Pharmacokinetics of Altrenogest via a Self-Nanoemulsifying Drug Delivery System

　　

背景：烯丙孕素（ALT）是一种用于猪和马发情同步化的合成孕激素，其口服吸收差，严重限制了应用。自纳米乳化给药系统（SNEDDSs）被认为可有效应对这些挑战，该系统在接触胃肠液后自发形成细小的水包油型纳米乳，从而增强亲脂性药物的溶出和生物利用度。目的：为提高ALT的口服生物利用度，本研究开发了载ALT的SNEDDS。利用MDCK单层细胞研究细胞摄取机制，同时在大鼠中进行体内药代动力学和原位肠灌流研究，以评估全身吸收、淋巴转运潜力和肠道通透性。方法与结果：体外实验显示，ALT-SNEDDS在浓度高达12.8 μg/mL时对MDCK细胞无明显毒性。ALT-SNEDDS的摄取呈时间和能量依赖性，涉及网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用。在大鼠中，与油基制剂相比，ALT-SNEDDS及其水合形式使Cmax和AUC显著升高，口服生物利用度分别提高1.96倍和4.97倍。放线菌酮阻断后血浆浓度显著下降，证实了淋巴途径的参与。肠灌流结果显示，ALT-SNEDDS的Ka和Peff值显著高于游离ALT，确认小肠吸收增强。急性经口毒性研究中，单次40 mg/kg口服剂量未引起大鼠主要器官明显的组织病理学异常。结论：综上，SNEDDS平台显著促进了ALT的吸收并表现出淋巴转运倾向，为后续制剂优化及目标物种评价奠定了基础。

一、研究背景与意义

烯丙孕素（ALT）是一种合成的甾体类孕激素，广泛应用于猪和马的生殖管理，特别是发情同步化。其药理作用主要通过孕激素受体依赖性的下丘脑-垂体-性腺轴负反馈来实现，通过抑制促性腺激素释放激素分泌，进而降低卵泡刺激素和黄体生成素的释放，从而延缓卵泡发育并阻止治疗期间的发情。停药后，垂体功能恢复，循环中的促性腺激素增加，同步化的卵泡成熟导致更可预测的发情和排卵。

然而，ALT的口服应用受到其不利理化性质的严重限制。ALT高度亲脂且水溶性差，在25°C时水溶解度约为0.04 mg/mL，logP为3.9，属于典型的生物药剂学分类系统II类药物。较差的水溶性会限制其在胃肠液中的溶出，导致口服给药后吸收不完全或不稳定。传统的剂型包括片剂、软胶囊和油溶液，但未能完全解决亲脂性甾体药物相关的溶出和吸收障碍。虽然已有多种制剂策略被探索，如注射用磷脂凝胶、环糊精包合物和乙基纤维素微囊，但这些方法大多制备工艺复杂、辅料成本高或需非胃肠道给药，更重要的是，大多数现有研究集中于制剂表征和体外释放，而对口服ALT制剂如何改善肠道吸收、上皮摄取和淋巴转运的详细证据仍然有限。

自纳米乳化给药系统（SNEDDSs）为增强水难溶性和亲脂性化合物的口服递送提供了有前景的策略。SNEDDSs是药物、油、表面活性剂和助表面活性剂的各向同性混合物，在胃肠液中稀释后在温和搅拌下自发形成细小的水包油型纳米乳。自乳化过程中产生的纳米级液滴提供巨大的界面面积，维持药物处于增溶状态，并改善其与肠黏膜的接触。此外，脂质基系统可通过改变上皮膜通透性、减少外排转运体活性以及促进与脂质消化产物的结合来增强吸收。对于足够亲脂的药物，这些系统还可能促进乳糜微粒介导的肠道淋巴转运，从而部分绕过肝脏首过代谢，提高全身暴露量。

因此，本研究旨在开发一种载ALT的自纳米乳化给药系统，并系统研究其口服吸收行为，为后续制剂优化和兽医临床应用提供机制基础。

二、主要研究方法

研究人员采用了以下关键技术方法：（1）通过伪三元相图和中心复合设计-响应面法优化ALT-SNEDDS配方；（2）利用MDCK细胞单层模型进行细胞毒性评价、细胞摄取定量分析和摄取途径探究；（3）在大鼠中进行体内药代动力学实验，比较ALT-SNEDDS与传统油基制剂的全身暴露水平；（4）采用放线菌酮诱导的淋巴阻断法评估肠道淋巴转运的贡献；（5）开展大鼠原位肠循环灌流实验测定肠道吸收速率常数和有效通透系数；（6）进行急性经口毒性研究并观察主要器官的组织病理学变化。

三、研究结果

3.1 ALT-SNEDDS的体外表征

ALT-SNEDDS的载药量为19.44±0.39 mg/g，包封率为98.85±0.69%。经100倍超纯水稀释后，制剂在35.76±1.10秒内自乳化形成澄清带蓝色乳光的O/W型纳米乳，平均粒径为18.39±0.03 nm，多分散指数为0.083±0.090，Zeta电位为-1.12±0.12 mV。透射电镜显示均匀球形液滴，无可见聚集。粒径在10至1000倍稀释范围内保持稳定，12小时内无相分离、浑浊或药物沉淀。

3.2 ALT-SNEDDS在MDCK细胞中的摄取机制

细胞毒性实验表明，当给药浓度为12.8 μg/mL或更低时，细胞活力保持在90%以上，后续细胞实验在此阈值以下进行。空白SNEDDS与载药SNEDDS的细胞毒性曲线几乎一致，表明细胞毒性主要由制剂辅料而非药物本身引起。

时间依赖性实验显示，细胞内平均荧光强度随孵育时间增加而增加，1小时后达到饱和。与游离香豆素6组相比，自纳米乳组的平均荧光强度在所有三个时间点均显著更高。低温实验表明，将温度从37°C降至4°C显著降低了MDCK细胞的平均荧光强度，表明SNEDDS的摄取依赖于温度或能量，涉及主动转运过程。

内吞抑制剂实验显示，所有四种内吞抑制剂（槲皮素、甲基-β-环糊精、氯丙嗪和秋水仙碱）处理组的细胞内荧光强度均显著低于对照组，表明SNEDDS的摄取可能与脂筏介导、网格蛋白介导、小窝蛋白介导的内吞以及巨胞饮作用有关。

共聚焦激光扫描显微镜定性分析证实，大量ALT-SNEDDS液滴被MDCK细胞摄取，绿色荧光集中在细胞核周围，而4°C条件下细胞内荧光强度明显弱于37°C正常摄取组。

3.3 ALT-SNEDDS在大鼠体内的药代动力学

药代动力学数据显示，所有制剂均符合二室模型并经历快速肠道吸收。ALT-SNEDDS组和ALT-SNEDDS-Water组的C_max分别为1.33±0.49 μg/mL和6.83±1.06 μg/mL，均显著高于ALT-Oil组的0.87±0.21 μg/mL。ALT-SNEDDS组和ALT-SNEDDS-Water组的AUC_(0-t)分别为5.14±1.89 μg/mL·h和13.03±1.42 μg/mL·h，显著高于ALT-Oil组的2.62±0.94 μg/mL·h，口服生物利用度分别提高1.96倍和4.97倍。ALT-SNEDDS-Water组的C_max和AUC也显著高于ALT-SNEDDS组，表明预水化和稀释增强了ALT的口服吸收。

淋巴阻断实验显示，腹腔注射放线菌酮后，血浆ALT浓度显著下降，C_max和AUC_(0-2h)与未处理组相比差异显著，表明ALT-SNEDDS-Water显示出淋巴转运倾向。

3.4 ALT-SNEDDS的原位肠道吸收特性

原位肠循环灌流实验中，ALT-SNEDDS组的吸收速率常数K_a为0.52，有效通透系数P_eff显著高于游离ALT组（K_a=0.14）。ALT-SNEDDS使K_a和P_eff分别提高了约3.7倍和4.4倍，表明ALT-SNEDDS增强了药物在小肠的吸收，从而改善了ALT的口服生物利用度。

3.5 急性经口毒性与组织病理学评价

在7天观察期内，各组均未出现死亡或异常临床症状，体重增长正常。各组心、肝、脾、肺、肾的脏器系数相当。ALT-SNEDDS组的心肌、肝小叶、肺泡、脾红髓和白髓、肾小球和肾小管均保持正常结构，未见坏死、炎性浸润、脂肪变性、纤维化或出血。单次口服40 mg/kg（约为临床剂量的100倍）未引起明显急性毒性或主要器官的组织病理学损伤。

四、讨论与结论

本研究所制备的ALT自乳化制剂经100倍稀释后平均粒径为18.39 nm，远低于100 nm阈值，明确属于SNEDDS范畴。这种极小粒径提供了巨大比表面积，有利于ALT溶出速率的提升，而窄粒径分布确保了液滴行为的均匀性。

在大鼠药代动力学实验中，ALT-SNEDDS-Water组的吸收半衰期短于ALT-Oil组，表明预水化加速了ALT的口服吸收。这可能是由于大鼠胃肠液体积有限，ALT-SNEDDS进入胃肠道后可能无法充分乳化，而预水化使制剂以更完全分散的状态进入胃肠道，增加了药物释放和吸收的有效表面积。

淋巴转运研究证实，淋巴途径参与了ALT-SNEDDS的吸收，这与亲脂性药物掺入脂质递送系统后可经由乳糜微粒介导的转运进入淋巴循环的既定观点一致。淋巴转运可避开肝脏首过代谢，间接提高全身生物利用度。

原位肠灌流实验证明，ALT-SNEDDS不仅改善了溶出，还增强了肠道通透性。与以往主要关注增溶或体外释放的研究相比，本研究提供了更强的生理学证据。

MDCK细胞摄取机制研究表明，ALT-SNEDDS的摄取是能量依赖性的主动过程，涉及多种内吞途径。这种多通路摄取模式与游离药物主要受限于溶出和被动膜渗透不同，ALT-SNEDDS通过改善增溶、淋巴转运潜力、增加肠道通透性和活跃的细胞内化等联合机制增强了吸收。

研究结论：与ALT油溶液相比，ALT-SNEDDS在大鼠药代动力学实验中使相对生物利用度提高1.96倍，水合给药效果更佳，相对生物利用度提高4.97倍，且ALT-SNEDDS显示出淋巴吸收倾向。与原药ALT相比，ALT-SNEDDS在大鼠原位肠循环灌流实验中显著改善了ALT在整个小肠的吸收。ALT-SNEDDS对MDCK细胞表现出低细胞毒性。在MDCK单层细胞模型中，ALT-SNEDDS的摄取呈时间依赖性和能量依赖性，摄取途径与脂筏介导、网格蛋白介导和小窝蛋白介导的内吞作用相关。此外，单次口服40 mg/kg剂量未引起大鼠急性毒性或主要器官的组织病理学变化。本研究构建的ALT-SNEDDS提高了ALT的口服生物利用度，为后续制剂开发奠定了基础，但在靶动物（母猪）中以临床相关剂量进行的进一步药代动力学和药效学研究仍需开展，以评估该制剂的转化潜力。