《Pharmaceutics》：Host Defense Peptides for Intracellular Bacterial Infections: Overcoming Translational Barriers Through Peptide Engineering and Nanotechnology-Based Drug Delivery Systems
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胞内细菌感染因病原体能够在宿主细胞内持续存在、逃避宿主免疫监视并降低对常规抗生素的敏感性，构成了重大的治疗挑战。因此，此类感染常伴随严重的临床表现、抗生素耐药、治疗失败及死亡率升高。宿主导向疗法（host-directed therapi
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胞内细菌感染因病原体能够在宿主细胞内持续存在、逃避宿主免疫监视并降低对常规抗生素的敏感性，构成了重大的治疗挑战。因此，此类感染常伴随严重的临床表现、抗生素耐药、治疗失败及死亡率升高。宿主导向疗法（host-directed therapies, HDTs）通过调节固有免疫和适应性免疫应答来增强宿主防御机制，从而促进胞内病原体的清除，已成为一种颇具前景的治疗策略。在这些策略中，宿主防御肽（host defense peptides, HDPs）因其兼具广谱抗菌活性和调节宿主免疫应答的能力而受到广泛关注。HDPs还能调控感染过程中的过度炎症阶段，从而限制过度的组织损伤及感染相关并发症。尽管在抗细菌感染的临床前研究中显示了良好的疗效，但肽类疗法的临床转化主要受其固有的药代动力学局限性所阻碍，包括稳定性差、易被蛋白酶快速降解以及生物利用度有限。然而，近年来在理性肽工程和基于纳米技术的递送系统方面取得的进展已显示出克服这些局限性的巨大潜力。本综述讨论了胞内细菌病原体在宿主细胞内定植与生存所采用的机制；重点阐述了HDPs在控制胞内细菌感染中的免疫调节作用，并着重审视了限制其临床转化的主要障碍；最后，总结了肽工程和靶向递送策略的最新进展，这些进展有助于开发基于HDPs的有效治疗胞内细菌感染的疗法。
### 论文主体内容专业总结
**2. 胞内细菌：巨噬细胞内的定植与生存机制**
**2.1 胞内细菌病原体**
胞内细菌病原体根据其对宿主细胞环境的依赖程度，被广泛分为专性胞内菌和兼性胞内菌。专性胞内菌依赖宿主代谢机制和营养物质进行生长与繁殖，无法在宿主细胞外复制；兼性胞内菌则既能在胞外环境生存，又具备侵入并在宿主细胞（尤其是巨噬细胞）内持续存在的能力。专性胞内菌包括无形体属、柯克斯体属、衣原体属、埃里希体属、东方体属、立克次体属等。兼性胞内菌如结核分枝杆菌、肠道沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、布鲁氏菌属等，常被巨噬细胞吞噬，但能够适应胞内环境并通过多种机制存活。专性胞内菌感染的治疗依赖能有效穿透宿主细胞并在胞内区室保持活性的抗生素，而兼性胞内菌感染因病原体可存在于胞外和胞内两种形式、形成休眠群体、逃避宿主免疫及产生多药耐药，治疗更具挑战性。
**2.2 巨噬细胞在细菌感染中的固有免疫功能**
巨噬细胞是专职吞噬细胞，表达多种模式识别受体（PRRs），如Toll样受体（TLRs）、NOD样受体（NLRs）、甘露糖受体（CD206）等。这些受体识别病原体相关分子模式（PAMPs），触发吞噬杯形成及吞噬体成熟，并与溶酶体融合形成吞噬溶酶体。该酸性区室通过降解酶、抗菌肽和活性氧（ROS）等介导病原体杀灭。此外，巨噬细胞通过产生细胞因子和趋化因子协调免疫应答，并通过主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子向CD4+ T细胞呈递抗原，连接固有免疫与适应性免疫。巨噬细胞的功能可塑性表现为M1样（经典活化）和M2样（替代活化）两种极化表型，胞内病原体常利用此特性建立允许其持续存在和复制的微环境。
**2.3 胞内细菌对巨噬细胞防御的破坏机制**
胞内细菌通过多种策略逃避巨噬细胞的杀灭作用。在表面修饰方面，病原体可通过修饰脂质A、肽聚糖或O抗原，降低PRRs对其的识别，从而减弱炎症反应。在毒力因子分泌方面，细菌利用Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅵ型和Ⅶ型分泌系统向宿主细胞递送效应蛋白，调节囊泡运输、吞噬体成熟、细胞骨架动力学及免疫信号通路。在宿主信号调控方面，病原体干扰JAK–STAT、MAPK、PI3K/Akt等信号通路，抑制巨噬细胞活化及ROS产生。在巨噬细胞极化调控方面，多数胞内病原体抑制M1样极化并促进M2样极化，形成允许细菌持续存在的微环境。在阻断吞噬体成熟方面，病原体通过消耗磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）或干扰Rab GTPase介导的囊泡运输，阻止吞噬体与溶酶体融合。在逃避自由基杀伤方面，细菌干扰NADPH氧化酶组装或表达超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等抗氧化酶以中和ROS。在营养物质与代谢环境操控方面，病原体通过形成沙门菌诱导丝状体（SIFs）获取氨基酸，分泌铁载体获取铁，并利用宿主脂肪酸和胆固醇作为碳源。在自噬逃逸方面，病原体通过伪装表面蛋白、募集宿主蛋白、上调宿主微小RNA或分泌效应蛋白等方式抑制自噬清除，如胞内肺炎克雷伯菌通过上调组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）导致H3K18去乙酰化，从而降低自噬活性并促进免疫抑制表型。
**3. 宿主防御肽**
**3.1 分类**
宿主防御肽（HDPs）根据结构构象分为α-螺旋肽、β-折叠肽、线性延伸肽和α-螺旋/β-折叠混合肽等类别。α-螺旋肽是最常见的类别，缺乏半胱氨酸残基和二硫键；β-折叠肽通过分子内二硫键增强结构刚性；线性延伸肽通常富含甘氨酸、脯氨酸和色氨酸等特定氨基酸；环状肽通过末端或残基间的共价键形成闭合环状结构，增强稳定性和抗蛋白酶降解能力。根据氨基酸组成，当某种氨基酸占序列超过25%时，可分为脯氨酸丰富、甘氨酸丰富、组氨酸丰富、精氨酸丰富和色氨酸丰富肽。根据生物来源，天然HDPs广泛分布于细菌、古菌、原生生物、真菌、植物和动物中，其中动物来源最为多样。根据药理活性，抗菌肽占约60%，抗真菌肽约占26%，此外还有抗病毒、抗寄生虫、抗炎、抗氧化、抗癌及促伤口愈合等多种功能类别。
**3.2 宿主防御肽作为抗胞内细菌的免疫调节剂**
针对结核分枝杆菌，LL-37通过促进含菌吞噬体与溶酶体融合增强巨噬细胞杀菌活性，同时调节TNF-α、IL-17、TGF-β和IL-10等细胞因子以控制过度炎症。人中性粒细胞肽-1（HNP-1）通过抑制细菌DNA和脂质合成发挥抗分枝杆菌活性，并在小鼠模型中显著降低肺、肝、肾和脾的细菌载量。铁调素定位于感染吞噬体并发挥直接抗分枝杆菌活性。乳铁蛋白通过IFN-γ介导的一氧化氮（NO）合成、促进吞噬体成熟及增强Th1型免疫应答等多种机制杀灭胞内结核分枝杆菌。先天防御调节剂（IDR）肽如IDR-1002、IDR-HH2和IDR-1018通过诱导中间型M1–M2巨噬细胞极化、促进趋化因子产生及抑制肺部炎症发挥治疗作用。针对肠道沙门菌，人β-防御素（HBD-1和HBD-2）组合可改善感染小鼠存活率并减少组织损伤；抗菌肽JH-3降低沙门菌胞内存活并抑制IL-2、IL-6和TNF-α产生。针对布鲁氏菌，HPA3P通过调节TNF-α和IFN-γ抑制布鲁氏菌在巨噬细胞内的存活；针对OMP31和OMP25的合成肽分别通过诱导特异性免疫应答或抑制细菌内化发挥作用。针对金黄色葡萄球菌，CATH-2和LL-37表现出直接抗菌活性，IDR-1018显著降低受感染巨噬细胞数量及胞内细菌载量；合成肽WR-12和D-IK8具有抗耐药菌和抗生物膜活性。针对其他胞内菌，HBD2和HBD3通过下调早期生长反应基因抑制铜绿假单胞菌在巨噬细胞内的存活；Jelleine-1通过增加膜通透性杀灭单核细胞增生李斯特菌并调节免疫应答；SK1260在发挥直接杀菌作用的同时抑制IL-6和TNF-α分泌并维持IL-10水平。这些研究共同表明HDPs可作为兼具直接抗菌和免疫调节功能的多功能治疗剂。
**4. HDP治疗的局限性与临床转化挑战**
尽管大量证据支持HDPs作为感染性疾病治疗候选物，但只有少数进入临床评估。截至当前，仅七种肽源性抗菌药物获批用于临床，且主要发挥直接杀菌作用。DRAMP 4.0数据库收录了30260条肽序列，但仅96个候选物进入临床试验。限制临床转化的主要因素包括：高制造成本（固相肽合成每克肽50–400美元，而氨基糖苷类抗生素约0.85美元）；生理条件下抗菌活性显著降低（二价阳离子、阴离子多糖和糖胺聚糖干扰静电相互作用）；宿主细胞毒性（如短杆菌肽、多黏菌素、indolicidin、melittin等引起肾毒性、神经毒性和溶血）；以及不利的药代动力学特性（肽聚集、快速清除、半衰期短等）。
**5. 提高宿主防御肽临床转化潜力的策略**
**5.1 肽工程与肽的合理设计**
工程化改造可优化HDPs的阳离子电荷、疏水性、两亲性和结构构象，从而提高活性、安全性和稳定性。研究人员通过引入保守五肽基序（FLPII）增强抗菌和免疫调节活性。对Cathelicidin-BF15衍生物进行二硫键环化修饰后，获得的环状肽ZY4抗蛋白酶降解能力增强，体内半衰期约1.5小时。通过合理设计RR类似物，获得的RR4表现出强效免疫调节和抗生物膜活性，并在盐、血清和酸性条件下保持抗菌活性。主链环化和二聚化可显著提高KR-12的生物稳定性。聚乙二醇（PEG）化修饰通过空间位阻和延缓肾清除延长循环时间，并改善IDR-1018的安全性和溶解性。脂化修饰通过促进与血清白蛋白的可逆结合减少酶降解。将非天然氨基酸（如D-赖氨酸、D-精氨酸、Aib、Hor）替代L-氨基酸可提高蛋白酶抗性，但需注意并非所有修饰均能改善体内性能。
**5.2 基于纳米技术的药物递送系统**
纳米粒递送系统可保护肽免受酶降解、提高生物利用度并实现位点特异性递送。金纳米粒偶联HDP可有效渗透巨噬细胞并清除胞内沙门菌。银纳米粒可与HDP协同增强抗菌活性。树枝状介孔二氧化硅纳米粒共递送抗菌肽G818和巨噬细胞极化调节剂，在金黄色葡萄球菌骨感染模型中促进细菌清除和组织再生。脂质体可改善肽的稳定性及递送效率，胆固醇修饰的DP7自组装纳米胶束在系统给药后表现出改善的安全性和疗效；脂质纳米粒共递送脂化TAT肽和编码cathelicidin的mRNA，对胞内外细菌提供双重抗菌策略。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒可递送源于esculentin-1a的HDP，单次气管内给药在36小时内使铜绿假单胞菌载量降低约3个对数级。壳聚糖纳米粒因其生物相容性和固有抗菌活性被用于递送多种HDPs。针对巨噬细胞靶向递送策略，研究人员设计了包含巨噬细胞靶向肽tuftsin、细胞穿透肽TAT和组织蛋白酶可裂解Val-Cit接头的多功能肽纳米平台，可实现选择性靶向巨噬细胞并高效清除胞内金黄色葡萄球菌。另一种创新方法是将编码抗菌肽1B376的mRNA封装于维生素衍生脂质纳米粒中，通过组织蛋白酶介导的裂解在溶酶体内特异性释放活性肽，有效杀灭巨噬细胞内的耐药菌。
**5.3 细胞穿透肽**
细胞穿透肽（CPPs）是能够跨过宿主细胞膜而不破坏膜完整性的短肽。将HDP NZ17074衍生物与CPPs N2和Tat II共价偶联，可通过巨胞饮和网格蛋白介导的内吞作用高效递送至感染巨噬细胞并清除胞内沙门菌。嵌合肽TAT-KR-12对浮游和胞内金黄色葡萄球菌均表现强效活性。自组装纳米肽整合细胞穿透和抗菌功能，可穿透宿主细胞膜清除胞内细菌并抑制炎症反应。此外，多功能嵌合肽纳米组装体包含自组装核心、细胞穿透基序、酶响应连接子和靶向配体，可在细菌酶作用下促进细胞摄取并靶向胞内细菌。少数天然或工程化CPPs本身具有内在抗菌活性，可直接清除胞质或膜结合囊泡内的细菌。
**6. 结论与展望**
在抗生素耐药时代，胞内细菌感染构成重大治疗挑战。HDPs因其双重抗菌和免疫调节功能成为有前景的治疗候选物。然而，临床转化仍受制于胞内生物利用度差、快速蛋白酶降解、药代动力学特性欠佳、高浓度细胞毒性及生产成本高昂等挑战。肽工程和纳米技术的进展已在多个方面改善上述局限性，但多数策略仍处于临床前阶段。未来研究应聚焦于建立标准化临床前评估框架、开发临床相关的胞内感染模型、开展全面的免疫学和毒理学评估，并改进可规模化且成本效益高的生产工艺。将人工智能和机器学习与理性肽工程相结合，有望加速发现和优化具有改善抗菌活性、胞内靶向性、药代动力学特性和安全性的HDPs。总体而言，HDPs疗法的成功临床转化需要肽设计、靶向递送、制剂开发、严格的临床前和临床评估、可规模化制造及监管标准化等方面的协同努力。
