新型抗癫痫双环去甲二萜的发现：源自海洋藻类内生真菌Chloridium sp. NBU3282的研究

《Marine Drugs》：Discovery of a Novel Antiepileptic Bicyclic Norditerpenoid from the Marine Algae-Derived Fungus Chloridium sp. NBU3282

　　

从海洋藻类来源真菌*Chloridium* sp. NBU3282中分离得到两种抗癫痫代谢产物：nordichloridene（1）和9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶（2）。Nordichloridene（1）是一种新型去甲二萜，具有与α,β-不饱和甲基乙烯基酮侧链共轭的双环6/6反式十氢萘骨架。通过综合分析光谱学数据确定了其结构，并借助NOESY波谱学结合量子化学计算确立了立体化学构型。化合物2此前仅见于合成化学领域，本研究首次从天然来源中鉴定获得该化合物。两种化合物均可抑制戊四唑诱导的斑马鱼癫痫模型中的过度活跃行为，表明其通过激活乙酰胆碱酯酶及调节癫痫相关基因发挥抗癫痫潜力。

**一、研究背景与科学问题**

癫痫是一种影响全球超过7000万人的常见慢性神经系统疾病，以反复自发性发作为特征，给患者带来严重的心理和生理负担。尽管抗癫痫药物（antiepileptic drugs, AEDs）的研发已取得显著进展，但约30%的患者因治疗耐药而仍然难以控制发作；多药耐药机制（如血脑屏障上外排蛋白的过表达）进一步削弱了AEDs的疗效。此外，现有药物常伴随不良反应。因此，开发更有效且更安全的新型抗癫痫候选药物，尤其是针对耐药性癫痫患者，已成为迫切的临床需求。

海洋来源微生物已被证明具有合成治疗神经系统疾病独特代谢产物的潜力。*Chloridium*属真菌以产生多种生物活性代谢物著称，但在中枢神经系统（central nervous system, CNS）药物研发领域的药理潜力尚未被充分挖掘。研究人员以生物活性为导向，从海洋藻类来源真菌*Chloridium* sp. NBU3282中发现了两种抗癫痫代谢产物：nordichloridene（1），一种具有双环6/6反式十氢萘核心并共轭α,β-不饱和甲基乙烯基酮结构的新型去甲二萜；以及9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶（2），该化合物此前仅作为合成化合物报道，本研究首次从自然界分离获得。该发现为抗癫痫药物研发提供了结构新颖的先导化合物，并拓展了海洋真菌在神经药理领域的应用前景。

**二、研究内容与意义概述**

研究人员开展了系统的天然产物化学与药理学研究：从海洋藻类来源真菌*Chloridium* sp. NBU3282的大规模发酵产物中分离纯化获得两种化合物，通过综合波谱学分析阐明其平面结构和立体构型，并利用斑马鱼戊四唑（pentylenetetrazole, PTZ）癫痫模型评价其抗癫痫活性及作用机制。研究结果表明，两种化合物均能有效抑制PTZ诱导的斑马鱼癫痫样过度活跃行为，其机制涉及乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）激活及癫痫相关基因表达的调节。这一发现不仅首次报道了化合物2的天然来源，也首次揭示了化合物1的抗癫痫潜力，为海洋真菌来源天然产物在抗癫痫药物研发中的应用提供了新的方向和实验依据。

**三、关键技术方法概述**

研究人员采用活性追踪分离策略，从海洋藻类样本中分离获得真菌菌株NBU3282（经ITS序列分析鉴定为*Chloridium* sp.，与参考序列一致性99.8%，NCBI登录号OQ507332），经大米固体培养基规模化发酵后，以乙酸乙酯萃取获得粗提物，并依次通过硅胶中压液相色谱（MPLC）、ODS反相MPLC及半制备高效液相色谱（HPLC）分离纯化得到化合物1（3.2 mg）和化合物2（1.5 mg）。结构鉴定综合运用了高分辨质谱（HRESIMS）、一维/二维核磁共振（NMR）波谱分析、紫外（UV）、红外（IR）光谱及电子圆二色谱（ECD）实验与量子化学计算。绝对构型通过NOESY实验结合ECD计算（PBE1PBE/def2-TZVP/PCM水平）确定。抗癫痫活性评价采用5 dpf斑马鱼幼鱼PTZ癫痫模型（每组n=100），以卡马西平（carbamazepine, CBZ, 50 μM）为阳性对照，通过行为学追踪（EthoVision XT 10.0系统）评估运动参数，并检测AChE活性及癫痫相关基因（*c-fos*、*gria1b*、*gat1*）的mRNA表达水平。

**四、研究结果**

**4.1 结构鉴定**

Nordichloridene（1）为白色无定形粉末，HRESIMS给出m/z 275.2376 [M+H]⁺（计算值C₁₉H₃₁O，275.2375），确定分子式C₁₉H₃₀O，不饱和度为5。1H NMR显示三个烯氢信号（δ_H 5.07 br s, 7.15 d, 5.97 d）及六个甲基信号（三个双峰、三个单峰）。13C NMR和DEPT-135谱证实19个碳，包括两个亚甲基、五个次甲基、一个饱和季碳、一个不饱和季碳及一个共轭羰基碳（δ_C 198.0）。综合2D NMR（COSY、HMBC）分析确定了化合物1的平面结构为具有6/6双环稠合骨架、C-10位连接α,β-不饱和甲基乙烯基酮侧链的去甲二萜。NOESY实验中H-11与H-9/H₃-16/H₃-19的相关性表明这些质子位于β面，而H-4/H-6/H-8及H₃-15?H-1/H-12的NOE网络定义了α面空间构型。结合ECD计算结果与实验数据比对，最终确定化合物1的绝对构型为1S,4R,6S,8R,9S,10R。

化合物2为浅黄色粉末，通过1H/13C NMR数据与文献报道的三环吖啶衍生物比对，确认其结构为9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶，这是该化合物首次从天然来源被分离鉴定。

**4.2 抗癫痫活性评价**

在PTZ诱导的斑马鱼癫痫模型中，PTZ给药导致斑马鱼出现显著过度活跃行为，表现为总运动距离、平均速度、高活动频率及运动正弦度较对照组明显增加。经化合物1和2（5.0 mg/L）处理后，上述行为异常被有效缓解，运动参数恢复至与50 μM CBZ阳性对照组相当或更优水平，表明两种化合物均可显著抑制癫痫相关过度活跃行为。

AChE活性检测显示，CBZ处理组AChE活性较对照组显著升高（p < 0.001），而化合物1和2（5.0 mg/L）处理组AChE活性进一步升高（p < 0.001），其中化合物1效果最为显著，提示两种化合物的抗癫痫作用可能通过胆碱能通路调节介导。

基因表达分析表明，PTZ诱导的癫痫发作显著上调*c-fos*和*gria1b*（AMPA型谷氨酸受体亚基）的表达，同时下调*gat1*（谷氨酰胺转氨酶1）的表达。经化合物1和2处理后，上述基因表达均被有效恢复至接近对照组水平，说明两种化合物有助于恢复兴奋性谷氨酸能神经传递与抑制性GABA能神经传递之间的平衡，这一平衡对维持正常神经元兴奋性和预防癫痫发作至关重要。

**五、讨论与结论总结**

讨论部分指出，化合物2已被认为是开发治疗神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）多种潜在化合物的关键前体，但此前未见其抗癫痫活性的报道。化合物1尽管与已知在多种药理背景下被研究的化合物具有结构相似性，但尚无研究证明其作为抗癫痫先导化合物的潜力。因此本研究是首次对化合物1在癫痫模型中的抗癫痫活性进行系统研究，为其治疗应用提供了新见解。

研究结论：本研究成功从海洋藻类来源真菌*Chloridium* sp. NBU3282中分离获得一种先前未描述的双环去甲二萜nordichloridene（1）及一种仅通过合成方法报道过的化合物9-氯-1,2,3,4-四氢吖啶（2）。结构上，nordichloridene（1）以其独特的双环去甲二萜骨架和罕见的甲丙烯酮（methacrylic ketone）结构片段而与众不同，在真菌代谢产物中极为罕见。两种化合物在PTZ诱导的斑马鱼癫痫模型中均表现出显著抗癫痫活性，尤其在缓解PTZ诱导的过度活跃、适度增强AChE活性以及恢复兴奋性与抑制性神经传递平衡方面显示出良好效果。上述发现突出了海洋真菌作为结构多样且具有生物活性化合物的宝贵来源的潜力，为抗癫痫药物研发提供了新途径。未来应开展天然产物类似物合成、合成药物化学及生物合成研究，以进一步促进抗癫痫药物的发现与开发。