机器学习辅助评估半月板仿生压电纳米纤维支架的拓扑依赖性细胞响应

《Journal of Functional Biomaterials》：Machine Learning-Assisted Evaluation of Topography-Dependent Cellular Responses in Meniscus-Mimetic Piezoelectric Nanofibrous Scaffolds

　　

静电纺丝纳米纤维支架能够提供调节细胞行为的拓扑线索；然而，由于结构参数和材料参数同时作用，支架设计与多维生物学响应之间的关系仍难以界定。在本研究中，研究人员制备了具有不同纤维结构和组成的半月板仿生压电纳米纤维支架，并利用机器学习（machine learning, ML）系统评估了其细胞响应。研究人员制备了具有随机、取向和径向纤维结构的聚偏氟乙烯（poly(vinylidene fluoride), PVDF）基支架，包括含有钛酸钡（barium titanate, BaTiO₃）和多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs）的复合支架。对支架形貌和纤维组织进行了定量表征，并通过DAPI、F-actin和SRY-box转录因子9（SRY-box transcription factor 9, SOX9）荧光成像分析了培养于支架上的间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）。定量图像分析揭示了支架依赖性的细胞数量、核形态与取向、细胞骨架组织及SOX9相关表型的差异，表明细胞对纤维拓扑结构和材料组成表现出不同的响应。随后，研究人员将支架和细胞参数整合为定量数据集，以开发和比较多种用于模拟支架依赖性细胞响应的机器学习模型。该机器学习框架捕捉了支架特征与多维生物学结果之间的关系。这些发现建立了一种将静电纺丝支架设计与细胞行为联系起来的实验-计算相结合的方法，并为半月板仿生压电支架的合理评估与优化提供了数据驱动的框架。

**研究背景与科学问题**

半月板是膝关节中具有高度有序细胞外基质的纤维软骨组织，在负荷分配、减震、关节稳定和润滑中发挥关键作用。其生物力学功能与胶原纤维的空间排列密切相关：环向胶原束构成主要结构框架并抵抗关节负荷产生的环向拉伸应力，径向连接纤维穿越环向束并抵抗纵向劈裂；半月板不同区域的纤维排列差异形成局部微环境。因此，在仿生支架设计中重现这些异质纤维结构至关重要。

静电纺丝技术可在微纳尺度控制纤维形貌、取向和材料组成，通过调整收集器构型可制备随机、单轴取向和径向取向纤维，提供不同的接触引导拓扑线索。压电生物材料因机械形变可产生局部电信号而受到关注，聚偏氟乙烯（PVDF）因电活性结晶相、机械稳定性和电纺相容性被广泛研究，掺入钛酸钡（BaTiO₃）和多壁碳纳米管（MWCNTs）可进一步改变纤维结构和机电特性。然而，支架设计参数多样且同时作用，传统评估多依赖单一生物学终点，难以全面表征细胞对复杂支架环境的整体响应。定量细胞成像可提供核形态、细胞骨架组织和分子标志物等多维信息，但整合分析需要计算手段。为此，研究人员将实验表征与机器学习（ML）相结合，系统研究半月板仿生压电支架结构特征与多维细胞响应之间的关系。

**研究内容与总体结论**

研究人员制备了具有随机、取向和径向纤维结构及不同材料组成的PVDF基压电纳米纤维支架，通过DAPI、F-actin和SOX9荧光成像定量表征人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的响应，构建半月板仿生支架质量指数（MMS-QI），并开发多种机器学习模型预测该指数。结果显示MMAWE模型实现最佳预测（R²=0.853±0.041），建立了将电纺支架设计与细胞行为联系起来的实验-计算框架，为半月板仿生压电支架的合理评估与优化提供了数据驱动基础。

**主要技术方法**

研究人员采用静电纺丝技术，通过胶带辅助收集器构型制备随机和取向纤维，采用环-针电极构型制备径向纤维，在16 wt%和20 wt% PVDF浓度下制备纯PVDF及PVDF/BTO/MWCNT复合支架。运用FE-SEM结合FFT分析和OrientationJ定量表征纤维形貌、直径、孔隙率与取向，TEM验证纳米材料掺入。hBMSCs（ATCC, PCS-500-012）以2×10⁴细胞/孔接种，通过DAPI、F-actin和SOX9荧光成像结合Cellpose核分割和结构张量分析提取定量参数，整合为MMS-QI。比较Ridge回归、随机森林、CNN和MMAWE等模型预测性能，采用SHAP分析解释模型。

**研究结果**

**设计与制备**：研究人员构建随机-径向-取向-径向-随机五层半月板仿生结构概念，SEM和OrientationJ假彩色图谱证实不同纤维组织，TEM确认BTO纳米粒子和MWCNTs成功掺入PVDF纤维。

**结构表征**：16 wt% PBM支架在三种取向下纤维直径和孔隙率保持可比，表明收集器调控主要改变纤维空间组织而非基本纤维形成特性。20 wt%浓度导致纤维直径增大和形态不规则，PVDF-R20因纤维沉积减少呈现高孔隙率和大孔尺寸。

**实验设计**：建立9个实验条件，包括6个纤维支架组（PBM-R16、PBM-A16、PBM-Rad16、PBM-R20、PVDF-R16、PVDF-R20）和3个TCP参照组（TCP-5K、TCP-10K、TCP-20K），所有支架组以2×10⁴ hBMSCs接种。

**核形态与组织定量**：Cellpose深度学习核分割显示核数量（平均137.04±50.10）、核伸长（平均1.496±0.073）和核排列指数（平均0.266±0.168）在各条件下存在差异，表明支架环境影响局部细胞占据和核形态适应。

**细胞骨架组织**：F-actin成像显示纳米纤维支架上细胞呈细长形并沿纤维方向延伸，TCP上细胞广泛铺展无优势方向。PBM-R16、PBM-A16和PBM-Rad16之间细胞形态差异显著，支持接触引导是细胞组织的主要决定因素。

**SOX9表达定量**：核分辨SOX9分析显示SOX9阳性核比例平均29.30±14.24%，背景校正核SOX9强度平均5.871±4.911 AU，各条件间差异明显。

**MMS-QI多维整合**：构建包含细胞数量、半月板组织、SOX9表达三个领域的复合指数，SOX9域赋予更高权重。不同支架呈现不同域得分组合，表明单一参数不能代表整体细胞响应。

**机器学习预测**：Ridge回归（R²=0.723±0.078）、CNN（R²=0.784±0.099）和MMAWE（R²=0.853±0.041，MSE=18.362，MAE=3.386）表现较好，数据中存在线性和非线性关系。

**响应谱评估**：PBM-A16获最高MMS-QI（64.06±4.11），Z-score标准化热图显示不同条件可通过不同细胞特征组合达到相近综合分值。

**相关性分析**：Spearman相关显示SOX9阳性核比例与SOX9强度四分位距（IQR）正相关（ρ=0.95），与SOX9强度比负相关（ρ=?0.80）；细胞计数与核面积负相关（ρ=?0.85）。

**预测因子重要性**：排列重要性显示不同预测因子对MMS-QI预测贡献不均，模型依赖多变量组合信息而非单一支架参数。

**样本预测误差**：预测误差双向分布，模型捕捉MMS-QI总体变化但对特定条件存在偏差，提示当前实验空间有限。

**SHAP解释**：局部SHAP显示F-actin覆盖率对PBM-A16预测贡献最大（+3.50），全局重要性最高为SOX9核-背景强度比（平均|SHAP|=4.88）和核面积（4.29）。

**组特异性SHAP**：同一预测因子的贡献方向和大小随实验条件变化，高MMS-QI支架组中SOX9强度比等通常为正向贡献，TCP参照组中呈负向贡献。

**讨论与结论**

MMS-QI是研究特异性的整合描述符而非通用验证指标；模型预测性能为内部表现而非外部泛化证据；SHAP与排列重要性描述模型行为而非生物因果关系。研究建立了集成实验-计算框架，证明纤维结构和材料组成与不同细胞响应谱相关。PBM-A16比组成匹配的PBM-R16的MMS-QI高约12.7%，径向支架在半月板组织域得分最高（0.75±0.02）。MMAWE与最强单模型CNN相比，均方误差（MSE）降低约31.7%，平均绝对误差（MAE）降低约13.3%。未来需纳入更多支架配方、独立生物学验证、功能性细胞外基质相关标志物和机电表征，以建立更广泛的预测适用性。