《Foods》：Integrated Metabolomics and Amplicon Sequencing Reveal Microbial Succession and Metabolite Dynamics During Sojae Semen Praeparatum Fermentation
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淡豆豉（Sojae Semen Praeparatum，SSP）是一种兼具食用和药用价值的中国传统发酵豆制品。然而，SSP发酵过程中代谢物的动态变化及微生物群落的演替规律尚未得到充分表征。本研究将基于超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）的非靶向代
淡豆豉（Sojae Semen Praeparatum，SSP）是一种兼具食用和药用价值的中国传统发酵豆制品。然而，SSP发酵过程中代谢物的动态变化及微生物群落的演替规律尚未得到充分表征。本研究将基于超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）的非靶向代谢组学与16S rRNA基因和ITS扩增子测序技术相结合，探究了SSP发酵过程中的代谢物重塑、细菌和真菌群落的演替及其潜在关联。研究人员观察到清晰的阶段依赖性代谢物分离图谱，共检测到22,343个代谢特征，其中4,281个被推定注释。差异代谢物主要归属于氨基酸、二肽、脂质、碳水化合物和异黄酮类。蔗糖及其他碳水化合物在发酵过程中逐渐被消耗，而N-乙酰氨基酸、短链二肽、脯氨酸甜菜碱及一系列脂质代谢物则在发酵后期累积。微生物群落并非随机漂变：扩增子测序揭示了两个生物界内清晰的演替序列。细菌群落集中于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）内的属——主要为肠杆菌属（Enterobacter）、科萨克氏菌属（Kosakonia）和柠檬酸杆菌属（Citrobacter）——而真菌群落则由初期以根霉属（Rhizopus）为主导，转变为后期由曲霉属（Aspergillus）、毛霉属（Mucor）及若干次要分类单元形成的共优势结构。当将两组数据关联分析时，优势分类单元与归属于氮代谢、脂质和酚类途径的代谢物相关联。普罗克汝斯忒斯（Procrustes）分析表明真菌群落与代谢组之间存在潜在关联，而细菌的关联性则较弱；然而，两者之间耦合强度的差异并未经过直接检验。这些结果为质量控制和工艺优化提供了初步证据和基础，但需在独立批次中进行验证。
研究背景与目的
淡豆豉（Sojae Semen Praeparatum，SSP）是一种在中国兼具药用和食用历史的传统发酵豆制品，收录于《中华人民共和国药典》。其制备以黑豆为主要原料，经蒸煮后辅以桑叶和青蒿煎液进行自然发酵。不同于纳豆、天培等单一菌种或纯种发酵体系，SSP的发酵依赖于自发形成的多物种生态系统，其中细菌和真菌共同作用，影响风味形成、代谢物谱变化及生物活性代谢物的产生。尽管已有研究报道了SSP的加工工艺和化学组成，但其发酵过程中微生物群落演替与代谢物动态重塑之间的系统性耦合关系仍不清楚。此外，作为药食同源产品，发酵过程中的微生物安全性问题，如条件致病菌的富集和生物胺的积累，直接关系到消费者健康，但目前对全发酵过程的动态安全评估仍然有限。因此，本研究旨在填补这些空白，系统描绘SSP发酵过程中的代谢物变化和微生物群落演替，并探索优势微生物与差异累积代谢物之间的可能联系，具体目标包括：绘制两个发酵阶段（前发酵和后发酵）的动态代谢物图谱；表征草药煎液辅助发酵过程中的微生物演替模式；并强调后期肠杆菌科（Enterobacteriaceae）富集作为潜在安全问题的新视角。
研究方法与技术
为实现上述目标，研究人员采用了整合的多组学策略。首先，基于超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）的非靶向代谢组学用于全面分析代谢物谱的动态变化。其次，通过16S rRNA基因（V3-V4区）和ITS（ITS1区）扩增子高通量测序，分别解析细菌和真菌群落的组成与演替。所有样本均来自北京中医药大学实验室同一批次、三个平行发酵罐的罐级重复。代谢组学采集了代表关键阶段的三个时间点（蒸煮后未发酵YD0、前发酵终点YD1、后发酵终点YD2）的样本；微生物组则以更高时间分辨率采集了八个时间点（FJ1至FJ8）的样本。通过Spearman相关性分析和普罗克汝斯忒斯（Procrustes）分析，探索了优势微生物属与关键差异代谢物之间的关联。
研究结果
3.1 SSP发酵过程中代谢物谱的整体变化
基于UHPLC-HRMS分析，研究人员共检测到22,343个代谢特征，其中4,281个被推定注释。主成分分析（PCA）显示，YD0、YD1和YD2三组样本在正负离子模式下均呈现清晰的阶段性分离，表明发酵伴随整体化学成分的逐步改变。通过差异代谢物筛选，发现上调代谢物在所有比较组中均占主导地位，特别是在整个发酵过程（YD2 vs. YD0）中，上调比例高达71.0%。从30个代表性关键差异代谢物的热图分析可见，原料样本（YD0）中蔗糖、大豆苷和染料木苷丰度较高；中期（YD1）5-O-甲基染料木素和花生四烯酸显著增加；末期（YD2）则富集了N-乙酰酪胺和脯氨酸甜菜碱等氨基酸衍生物。代谢物分类显示，脂质、苯衍生物及氨基酸/肽类是主要类别。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析表明，氨基酸代谢、外源物质降解与代谢以及碳水化合物代谢是最主要的富集通路。值得注意的是，游离氨基酸动态分析显示，检测到的32种游离氨基酸中有22种（68.8%）在整个过程中丰度持续上升，反映了微生物驱动的渐进式蛋白水解作用。
3.2 SSP发酵不同阶段微生物群落组成的变化
扩增子测序揭示了清晰的微生物群落演替。细菌群落方面，早期未分类细菌占优；中期芽孢杆菌属（Bacillus）相对丰度急剧增加；末期肠杆菌属（Enterobacter）成为最优势属，科萨克氏菌属（Kosakonia）和柠檬酸杆菌属（Citrobacter）也同步上升。真菌群落方面，早期根霉属（Rhizopus）占据绝对主导；中期曲霉属（Aspergillus）丰度增加并与根霉属共存；末期真菌组合主要由曲霉属、未分类酵母目（Saccharomycetales）和根霉属构成。
3.3 微生物群落多样性分析
α多样性分析显示，真菌的丰富度（Chao1指数）始终高于细菌。真菌的香农（Shannon）指数在中后期出现波动，可能与清洗步骤去除表面真菌有关。细菌的香农指数在整个发酵过程中逐渐上升。β多样性分析的主坐标分析（PCoA）表明，细菌群落沿发酵时间线呈现出高度有序的分离（PCoA1解释了97.29%的变异），而真菌群落除初始样本外，中后期样本重叠较多，未形成清晰的阶段性聚类。置换多元方差分析（PERMANOVA）证实发酵阶段对细菌和真菌群落均有显著影响。
3.4 线性判别分析效应大小（LEfSe）差异物种分析
LEfSe分析识别了各发酵阶段的标志性微生物。细菌中，未分类细菌是FJ1的特征分类单元；FJ3阶段芽孢杆菌相关分类单元显著富集；后期（FJ6和FJ7）肠杆菌科相关分类单元成为优势生物标记物。真菌中，根霉属相关分类单元表征早期FJ2阶段；随着发酵进行，曲霉属和未分类酵母目等分类单元从FJ3到FJ8相继富集。
3.5 微生物与代谢物相关性网络分析
Spearman相关性分析显示，在经本杰明尼-霍赫贝格（Benjamini-Hochberg）校正后，细菌与代谢物的300个相关性均不显著，而真菌与代谢物的300个相关性中有11个保持显著。最强的真菌相关性出现在曲霉属与蔗糖之间（r=-0.93）。总体而言，肠杆菌科相关细菌主要与蛋白质降解产物（如氨基酸和二肽）呈正相关；丝状真菌（如根霉属、曲霉属和毛霉属）则与异黄酮和脂质代谢物显示出更强的关联。普罗克汝斯忒斯（Procrustes）分析进一步量化了全局一致性：真菌群落与代谢组存在显著关联（M2=0.5760，p=0.025），而细菌的关联性边缘显著（M2=0.6154，p=0.062），这与Spearman相关性分析的结果一致。
讨论与结论
讨论部分指出，SSP发酵中的代谢物重塑符合固态发酵的一般原理，即微生物利用植物基质释放的可发酵糖作为碳源，驱动生长和代谢活动。N-乙酰氨基酸和脯氨酸甜菜碱在发酵中后期的积累可能反映了微生物的氮代谢或对环境胁迫（如pH、氧张力、营养可用性变化）的应激响应。异黄酮从糖苷形式向苷元及硫酸化、葡萄糖醛酸化衍生物的转化，暗示了微生物β-葡萄糖苷酶的作用，这具有潜在的药理意义。微生物群落演替方面，根霉属在早期的优势与其分泌淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的能力相符；后期肠杆菌科的富集则可能与密封后发酵造成的低氧环境有关。与纳豆、清麴酱、天培、味噌和大酱等其他发酵豆制品相比，SSP的微生物群落结构和代谢重塑既有共性（如蛋白质降解和碳源消耗），也有独特性（如细菌后期以肠杆菌科为主而非芽孢杆菌，真菌演替更复杂，以及N-乙酰氨基酸和脯氨酸甜菜碱的显著积累）。研究还指出了潜在的安全性问题，即后期肠杆菌科及曲霉属和镰刀菌属的存在，但强调这仅是潜在风险，需通过物种水平鉴定、活菌计数、真菌毒素和生物胺定量来确认实际安全性。从质量控制角度，前发酵和后发酵的终点可作为关键控制点，碳水化合物的消耗、二肽和N-乙酰氨基酸的积累以及核心微生物属的演替动态可作为潜在的监测指标。然而，这些发现均基于单一批次发酵，需在多独立批次中验证。
研究结论翻译：
本研究整合了非靶向代谢组学和扩增子测序，揭示了SSP发酵过程中的代谢物动态和微生物演替。代谢物和微生物谱呈渐进式平行变化。在代谢物层面，含氮化合物，特别是蛋白质水解产物得以积累，而碳水化合物被消耗。微生物群落遵循有序的演替轨迹，肠杆菌科、芽孢杆菌属、根霉属、曲霉属和毛霉属成为可能参与碳氮代谢的主要分类单元。相关性和普罗克汝斯忒斯（Procrustes）分析表明，真菌群落与代谢组的关联比细菌群落更为紧密。这些发现建立了一个将微生物演替与代谢物周转相联系的时间框架，为选择发酵终点和为SSP生产不同阶段制定质量控制标志物提供了依据。然而，由于研究的观察性设计以及缺乏直接的安全性或营养学测量，这些微生物和代谢物关联仍是初步的。未来研究将聚焦于多批次验证、菌株分离、功能验证和系统安全性评估，旨在全面评估SSP的质量并提升其作为保健食品的安全性。
