热物理指导与序贯实验设计提升喷雾干燥Lactiplantibacillus plantarum微胶囊热稳定性

《Foods》：Thermophysically Guided Design of Spray-Dried Lactiplantibacillus plantarum Microcapsules with Improved Thermal Stability

　　

喷雾干燥和胃肠道转运可导致益生菌活力显著损失，从而限制其在食品应用中的有效递送。该研究开发了一种热物理指导框架，用于分三个序贯阶段合理设计Lactiplantibacillus plantarum微胶囊。首先，对11种生物聚合物候选材料进行Kissinger动力学分析（表观活化能E_a：95.4–198.4 kJ/mol）并结合pH依赖性溶解度分析，提供了用于预选包埋材料的经验筛选标准；这些活化能为与复合吸热事件相关的表观值，本工作未测定玻璃化转变温度（T_g）。其次，析因设计确定浓缩乳清蛋白（WPC）–阿拉伯胶为最合适壁材系统，干燥后存活率为97.76 ± 0.75%，并显示显著的蛋白质–多糖相互作用（p < 0.0001）。第三，D-最优混料设计优化了由海藻糖（29.7%）、甘油（25.7%）、低聚果糖（FOS，19.8%）和菊粉（24.8%）组成的四组分热保护剂共混物。拟合模型解释了91.9%的响应变异（R²=0.919），优化共混物限制了92 °C下3–8 min热暴露期间的活力损失，与涉及玻璃化和膜稳定的互补保护作用相一致。优化体系在喷雾干燥后获得2.4 × 10¹¹ CFU/g，水活度（a_w）为0.23，Carr指数（Carr Index）为18.5%。在模拟胃肠道消化（INFOGEST 2.0）下，热保护剂负载微胶囊在胃相后保留1.5 × 10⁷ CFU/mL消化物，并向肠相递送1.2 × 10⁸ CFU/mL消化物，比未保护微胶囊（1.0 × 10³ CFU/mL消化物）高四至五个数量级。总体而言，这些结果支持一种可迁移的配方策略，该策略将热物理筛选与实验设计相结合，以开发具有改善热稳定性的食品用益生菌配料。

益生菌（probiotics）补充调节肠道菌群已在肠易激综合征、炎症性肠病及系统性炎症生物标志物衰减中显示治疗潜力，但产业化受加工、无冷链储存和胃肠道转运造成的存活损失限制；文中指出损失可达3–5个对数级，使初始约10⁹ CFU/g降至低于10⁶ CFU/g。喷雾干燥（spray drying）因可放大和成本效益成为工业标准，但入口空气温度常为140–180 °C，可造成蛋白质变性、细胞膜脂质过氧化和快速渗透脱水；当出口温度超过70 °C时，Lactiplantibacillus plantarum存活率明显下降，且主要取决于包埋材料。食品热加工（如72 °C、15–90 s巴氏杀菌）及酸性果汁（pH 3.5–4.5）等基质还可能使亲水多糖过早溶解并导致益生菌提前释放。现有包埋材料和热保护剂选择多依赖经验，玻璃化转变温度（T_g）或动力学参数仅偶被作为明确设计标准，尚未见将候选材料热动力学分析、统计设计筛选壁材组合及热保护剂混合物整合于同一实验策略的系统框架。为此，该研究提出三阶段热物理指导框架，开发喷雾干燥L. plantarum微胶囊，以提高热稳定性和胃肠道递送，并假设将热物理参数纳入材料选择过程可优于经验筛选配方。研究人员依次开展热物理筛选、壁材析因筛选、热保护剂混料优化、优化微胶囊表征及INFOGEST 2.0胃肠耐受性评价，得出WPC–阿拉伯胶为最佳二元壁材，四元热保护剂优化可提高干燥后活菌负荷及胃肠存活，提供了替代经验选材的可迁移实验框架；但T_g未直接测定，部分机制为推断，且胃肠优势是相对未保护微胶囊而非游离细胞。

关键技术方法概括：采用差示扫描量热法（DSC）在5、10、20 °C/min下分析11种候选生物聚合物，以Kissinger法估算表观活化能（E_a），并在pH 4.0与8.0测定溶解度；用3×2析因设计筛选3种蛋白与2种多糖组合；用D-最优混料设计（20个运行）优化海藻糖、甘油、低聚果糖（FOS）和菊粉四元热保护剂，以92 ± 2 °C、2 min存活率为响应，并在3、5、8 min验证；对优化微胶囊测定a_w、水分、粒径、流动性和扫描电子显微镜（SEM）形貌；按INFOGEST 2.0评估胃肠存活。菌株L. plantarum ATCC 8014来自CECIF（哥伦比亚），材料来自哥伦比亚Medellín当地商业供应商。

3.1 包埋材料的热表征与溶解度：通过DSC-Kissinger分析和pH 4.0/8.0溶解度测定发现，11种候选在100–165 °C呈宽吸热转变，E_a为95.4–198.4 kJ/mol，WPC最低（95.4 kJ/mol），瓜尔胶最高（198.4 kJ/mol），微晶纤维素与胶原分别达175.3和152.7 kJ/mol，阿拉伯胶为112.4 kJ/mol；WPC与阿拉伯胶在酸性和碱性条件下呈互补溶解度。结论是E_a可作为经验预选指标，但单独不足以决定包埋性能，且该值为复合吸热事件的表观描述而非T_g测定。

3.2 包埋材料选择的析因设计：通过3×2析因设计比较WPC、大豆分离蛋白（SPI）、酪蛋白酸钙与阿拉伯胶、辛烯基琥珀酸酐（OSA）改性木薯淀粉的组合，发现蛋白类型、多糖类型及交互作用均显著影响干燥后活菌数和存活率；WPC–阿拉伯胶存活率最高（97.76 ± 0.75%），活菌数约7.1 × 10⁸ CFU/g且重复性较好；SPI–OSA改性木薯淀粉活菌数最高（9.8 × 10⁹ CFU/g）但变异较大、存活率较低（66.11%）；酪蛋白酸钙配方活菌数最低（≤2.0 × 10⁸ CFU/g）。结论是选择WPC–阿拉伯胶作为后续壁材系统。

3.3 热保护剂混合物优化：通过D-最优混料设计20个运行及92 ± 2 °C、2 min热挑战，发现存活率为5.43–14.32%，纯甘油最高（14.32%），纯菊粉最低（8.00–8.29%）；特殊三次Scheffé模型显著（R²=0.919，调整R²=0.781，预测R²=0.234，失拟不显著p=0.162），三元交互项ABC、ACD、BCD显著。数值优化获得5个候选配方，其中Mixture 5（海藻糖29.7%、FOS 19.8%、甘油25.7%、菊粉24.8%）在92 °C、3、5、8 min下存活最高且3–8 min无显著下降；但绝对存活仍低，主要意义在于保护效应随热负荷增加的稳定性。

3.4 优化微胶囊的表征：通过物性、微生物和SEM表征发现，热保护剂负载微胶囊干燥后活菌数为2.4 × 10¹¹ CFU/g，高于未保护微胶囊的8.5 × 10⁸ CFU/g（增加2.45 log CFU/g），存活率分别为73.16 ± 0.64%和58.42 ± 2.15%；92 °C、2 min后分别下降1.54和2.60 log，热抵抗分别为2.86%和0.25%；a_w分别为0.23和0.19，均低于0.25；水分分别为9.49%和8.12%；D_4,3分别为10.43和12.18 μm且无显著差异；Carr指数分别为18.5%和24.3%，Hausner比分别为1.20和1.32，负载后流动性改善；SEM显示主要为球形、表面完整并具干燥收缩性浅凹，无裂纹或壁不连续。结论是热保护剂负载提高干燥后载量和热挑战后残余活菌，并改善粉体流动性。

3.5 体外胃肠道存活：通过INFOGEST 2.0模拟消化发现，未保护微胶囊在胃相后仅保留1.0 × 10³ CFU/mL消化物，肠相后仍为1.0 × 10³ CFU/mL；热保护剂负载微胶囊胃相后为1.5 × 10⁷ CFU/mL，肠相后为1.2 × 10⁸ CFU/mL，较未保护微胶囊分别高4.2和5.1个对数级；游离L. plantarum细胞绝对计数最高（胃相4.0 × 10¹¹、肠相1.4 × 10¹⁰ CFU/mL消化物），且是唯一在转运中下降1.5个对数级的处理。结论是热保护剂负载而非单纯壁材包埋决定胃肠存活，但该优势是相对未保护微胶囊，而非相对游离细胞。

讨论部分总结：原文指出，Kissinger得到的E_a反映结合水脱附与高分子链松弛的复合过程，并非共价键降解或T_g测定；高E_a是必要但不充分条件，需与溶解度、成膜性、食品级和乳化性等共同评价。WPC低E_a可能与其蛋白和乳糖相关转变重叠有关，不应简单解释为热适用性差；WPC–阿拉伯胶的优势与蛋白主导界面膜形成、多糖提供水结合和基质凝聚、WPC中乳糖对无定形相和T_g的潜在贡献以及pH依赖性溶解度互补有关；酪蛋白酸钙因成膜偏黏性且较慢而表现较差，SPI–OSA改性木薯淀粉虽活菌数高但重复性差。热保护剂方面，原文认为海藻糖可能通过胞内玻璃化和水替代起作用，甘油可能提供较快的膜导向稳定但亦可能塑化基质，FOS和菊粉主要作为胞外渗透缓冲和基质形成组分；因T_g未测，机制归属为推断，模型主要用于描述和筛选而非外推预测，且热保护剂优化在悬液中进行，尚未与壁材和干燥过程完全耦合。物理结构和胃肠数据表明，低a_w、改善流动性及完整球形结构支持粉体稳定性；未保护WPC–阿拉伯胶壁材本身不足以在胃相保护细胞，内部渗透和膜稳定保护剂使胃转运可存活，且肠相计数升高可能与pH触发壁溶解和亚致死损伤恢复有关。

研究结论部分翻译：一种整合Kissinger热转变分析作为经验筛选描述符、pH依赖性溶解度分析和序贯实验设计的性质驱动方法，指导开发了具有改善热稳定性和胃肠道稳定性的喷雾干燥L. plantarum微胶囊。仅以热转变能（E_a）作为选择标准并不充分，但将其与成膜行为和pH依赖性溶解度共同解释时，可识别WPC–阿拉伯胶为最合适二元壁材系统（存活率97.76 ± 0.75%；显著蛋白质–多糖相互作用，p < 0.0001）。92 °C下的热保护取决于高阶多组分相互作用（p ≤ 0.022），优化四元共混物（海藻糖0.297、甘油0.257、FOS 0.198、菊粉0.248；总量2.5% w/v）使干燥后活力提高2.45 log CFU/g，并在整个模拟INFOGEST 2.0消化过程中维持约10⁷至10⁸ CFU/mL消化物的活菌数。与未保护对照的比较同样具有信息价值：不含内部保护剂的WPC–阿拉伯胶微胶囊在胃相中实际上被灭活，仅保留约10³ CFU/mL消化物的计数。因此，蛋白质–多糖壁主要作为物理屏障和肠道释放载体，其本身不足以支持胃内存活；内部渗透和膜稳定保护剂才使胃转运可存活。还应指出，该耐酸菌株的游离细胞保留了高于包埋体系的绝对计数，因此此处展示的胃肠道益处是相对于未保护微胶囊而非相对于游离细胞。仍需要直接测定完整优化体系的T_g、阐明WPC乳糖组分的贡献，并进行长期储存和食品基质验证。即便如此，该框架为设计热稳定益生菌配料提供了一种可迁移、经实验验证的替代经验材料选择的方案。