《Foods》：Combined Lactoferrin and Osteopontin Treatment Attenuates LPS-Induced Inflammatory Responses and Intestinal Injury in Macrophages and Mice
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本研究探讨了乳铁蛋白（lactoferrin，LF）与骨桥蛋白（osteopontin，OPN）联合处理的抗炎潜力，采用体外（脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的巨噬细胞）和体内（LPS诱导的肠道损伤）两种模型。结果显示，LF-OPN联
本研究探讨了乳铁蛋白（lactoferrin，LF）与骨桥蛋白（osteopontin，OPN）联合处理的抗炎潜力，采用体外（脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的巨噬细胞）和体内（LPS诱导的肠道损伤）两种模型。结果显示，LF-OPN联合处理在抑制巨噬细胞促炎介质表达方面优于单一蛋白治疗。在体内实验中，联合给药显著减轻了肠道屏障破坏并保留了黏膜结构，表现为绒毛高度、隐窝深度和杯状细胞数量的增加，其效果优于单独使用OPN。这种结构保护伴随着显著的免疫调节作用；联合处理较任一单一蛋白更有效地提升了全身及局部抗炎细胞因子水平，同时降低了促炎细胞因子水平。值得注意的是，在LF：OPN比例为1：1、5：1和10：1时，小鼠肠道白细胞介素10（Il10）浓度相对于LF组分别升高了44.25%、54.46%和60.02%；在同一三个比例下，肿瘤坏死因子α（Tnfα）浓度相对于OPN组分别下降了33.73%、52.27%和37.80%（所有p < 0.05）。这些数据揭示了LF和OPN在对抗急性炎症损伤方面具有强大的联合效应，提示其具有前景的治疗协同潜力。未来工作应着重阐明其潜在信号机制，并在慢性疾病模型中评估其疗效。
论文解读：乳铁蛋白与骨桥蛋白联合干预对脂多糖诱导炎症反应及肠道损伤的保护作用
一、研究背景与科学问题
肠道上皮屏障的完整性对于维持肠道稳态至关重要。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为革兰氏阴性菌外膜的主要成分，可被宿主模式识别受体识别并启动促炎信号，破坏上皮屏障完整性，最终导致LPS诱导的肠道损伤。此类损伤通常表现为肠道通透性增加、上皮形态改变、紧密连接完整性破坏及炎症介质表达上调。屏障功能障碍可能进一步促进LPS、细菌组分及其他肠腔抗原向固有层、门脉循环或体循环转位，放大局部炎症，并可能促成内毒素血症和低度全身性炎症。持续性或复发性肠道屏障功能受损及肠道来源的LPS转位与代谢功能障碍、脂肪肝及心血管风险升高等不良健康结局相关。因此，减轻LPS诱导的肠道损伤及其相关不良效应对于维持肠道及全身健康具有重要意义。
乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是一种具有铁结合能力的糖蛋白，广泛分布于生物分泌液中，在人乳、牛乳及其他哺乳动物乳汁中浓度尤其高。LF通过铁螯合和破坏细菌膜完整性发挥广谱抗菌活性；同时可抑制病毒附着与复制并诱导抗病毒免疫应答。此外，LF调节炎症信号、抑制促炎细胞因子产生并促进抗炎介质释放，具有广泛的抗炎和免疫调节特性。LF还可上调紧密连接蛋白表达、促进肠道干细胞增殖与分化、增强杯状细胞黏液分泌、维持肠道屏障完整性并抑制内毒素及细菌转位。
骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种多功能糖蛋白，在骨、肝、肠及乳腺等多种组织及乳汁、血液、唾液等体液中均有检出。OPN通过调节骨矿化、成骨细胞-破骨细胞黏附及骨重塑维持骨骼完整性。在肠道中，OPN促进上皮细胞增殖与分化、增加绒毛高度和隐窝深度、增强杯状细胞黏液分泌、维持肠道屏障完整性及肠道免疫稳态。在免疫系统中，OPN作为关键免疫调节介质，激活巨噬细胞、T细胞和NK细胞，调节促炎与抗炎细胞因子平衡，参与炎症调控、病原清除及免疫耐受维持。
既往研究已证实LF和OPN均可改善肠道屏障功能障碍。Li等人的研究表明，以LF：OPN=1：5比例联合给药对LPS诱导的小鼠肠道损伤具有保护作用，主要通过Notch–HES1通路增强肠道干细胞增殖及吸收性上皮细胞分化，同时恢复紧密连接蛋白表达并降低肠道通透性。然而，既往研究多局限于肠道衬里的结构和修复特征。本研究旨在通过互补的体外和体内实验模型，探讨LF和OPN是否具有联合抗炎效应，具体考察其减轻LPS诱导的巨噬细胞炎症激活及小鼠LPS诱导肠道损伤的能力。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员采用了体外与体内相结合的实验体系。体外实验使用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，经LPS刺激建立炎症模型；体内实验使用42只4周龄雄性C57BL/6N小鼠，随机分为7组，通过每日灌胃给予不同比例LF：OPN（1：1、5：1、10：1）或单一蛋白（各300 mg/kg体重），连续7天后除对照组外均腹腔注射200 μg LPS建立肠道损伤模型。主要技术方法包括：CCK-8细胞活力检测、FITC-葡聚糖肠道通透性测定、苏木精-伊红（H&E）染色评估肠道形态学、阿尔辛蓝染色计数杯状细胞、PAS染色计数分泌细胞、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测炎症相关基因转录水平、酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞裂解液、血清及空肠组织匀浆中细胞因子蛋白水平。
三、主要研究结果
3.1 LPS对巨噬细胞活力及炎症细胞因子表达的影响
研究人员首先评估不同浓度LPS对巨噬细胞活力的影响以确定非细胞毒性刺激浓度。1和5 μg/mL LPS均无显著细胞毒性，细胞活力分别为89.78%和81.38%。与未处理细胞相比，1 μg/mL LPS显著升高Tlr4、Myd88、Ccl2、Ccl3、Il1a、Il1b、Il6和Tnfa的mRNA水平，同时降低Il10 mRNA丰度。1 μg/mL LPS对Tlr4、Myd88、Il1a、Il6和Tnfa的诱导作用显著强于5 μg/mL，故后续细胞实验选用1 μg/mL LPS。
3.2 LF和OPN剂量及比例调节巨噬细胞存活和促炎介质转录丰度
LF或OPN在≥5 mg/mL剂量时显著降低细胞活力，而≤1 mg/mL浓度无显著影响，故干预浓度设为1 mg/mL。与LPS组相比，LF和OPN单药治疗均降低Tlr4、Ccl2、Ccl3、Il1a、Il1b、Il6和Tnfa转录水平并升高Il10。所有LF-OPN联合方案较LF单药进一步降低Tlr4和Il1b转录丰度；5：1和10：1比例还抑制Ccl2、Ccl3、Il1a、Il6和Tnfa。与OPN单药相比，所有联合组Tlr4、Ccl3、Il1a、Il1b、Il6和Tnfa均显著降低。1：1和5：1联合组的Il10表达显著高于任一单药组。
3.3 不同LF和OPN组合改变巨噬细胞内炎症因子蛋白水平
LPS刺激显著降低IL-4和IL-10蛋白水平，同时升高IL-6、IL-1β和TNF-α。所有蛋白处理组IL-4和IL-10均高于LPS组，IL-1β、IL-6和TNF-α均低于LPS组。所有联合方案IL-10蛋白丰度高于LF单药；5：1和10：1比例IL-10高于OPN单药。5：1比例IL-4显著高于任一单药。所有联合组IL-1β、IL-6和TNF-α均低于LF或OPN单药，其中IL-6降幅最显著。
3.4 不同LF和OPN组合影响小鼠体重和脾脏指数
LPS攻击后所有攻击组体重较对照组显著下降，蛋白处理组体重高于LPS组。1：1和5：1联合组体重显著高于任一单药组。LPS显著升高脾脏指数，LF单药及所有联合方案均显著降低脾脏指数，其中5：1比例效果最佳，较LF和OPN单药分别下降16.64%和22.54%。
3.5 不同LF和OPN组合调节肠道屏障通透性和黏膜结构
LPS显著增加肠道通透性，所有蛋白干预组均显著降低通透性，所有联合组通透性低于LF组，5：1比例效果最佳且与对照组无显著差异。LPS升高H&E组织病理学评分并降低绒毛高度、隐窝深度和绒毛/隐窝比。所有蛋白处理组均改善上述指标。5：1和10：1联合组组织病理学评分较OPN组分别降低26.69%和29.12%。所有联合组绒毛长度和隐窝深度均显著大于OPN组；5：1和10：1联合组隐窝深度较LF组分别增加30.66%和30.32%。
3.6 不同LF和OPN组合增强小鼠肠道组织杯状细胞数量
LPS显著减少杯状细胞数量，所有蛋白处理组均显著增加。所有联合组杯状细胞数量较OPN组增加12.54%、17.36%和15.50%；5：1和10：1联合组较LF组分别增加9.45%和7.72%。
3.7 不同LF和OPN组合提高小鼠肠道黏膜分泌细胞丰度
LPS显著降低分泌细胞数量，所有蛋白干预组均显著增加。所有联合组分泌细胞数量较OPN组增加18.60%、20.01%和20.83%；5：1和10：1联合组较LF组分别增加17.07%和17.87%。
3.8 不同LF和OPN组合减轻小鼠循环炎症介质浓度
LPS降低血清IL-4和IL-10水平并升高IL-1β、IL-6和TNF-α。所有蛋白处理组均升高IL-4和IL-10并降低促炎因子。所有联合方案IL-4和IL-10浓度均高于任一单药，IL-1β、IL-6和TNF-α均低于任一单药。不同比例联合组间无显著差异。
3.9 不同LF和OPN组合抑制小鼠肠道黏膜炎症介质转录水平
LPS降低肠道Il10转录水平并升高Tnfa、Il6和Il1b。所有蛋白处理组Il10均高于LPS组，所有联合方案Il10高于LF组。1：1和5：1联合组Il1b降幅最大，优于任一单药。所有联合方案Tnfa均低于任一单药。
四、讨论与结论
巨噬细胞作为肠道先天免疫系统的关键效应细胞，在调节肠道炎症中发挥重要作用。LPS促进巨噬细胞向促炎M1表型极化并抑制抗炎M2表型转化，而LF和OPN均可促进M2极化、抑制M1激活。本研究证实LF-OPN联合给药较单一蛋白更有效抑制巨噬细胞促炎基因表达，支持其联合抗炎应用价值。肠道通透性是屏障完整性的核心指标，LF和OPN单药均可降低LPS引起的通透性增加，而联合方案较LF单药效果更佳。肠道黏膜结构方面，联合方案在绒毛高度、隐窝深度、杯状细胞及分泌细胞数量上均优于单药治疗，提示其对肠道屏障结构和功能的保护具有协同增强效应。炎症细胞因子方面，所有联合方案在提升抗炎细胞因子Il10和抑制促炎因子Tnfa方面均优于任一单药，证实了LF和OPN的联合抗炎作用。研究人员仅从转录水平检测了Tlr4和Myd88，尚不能确立对TLR4信号通路的直接抑制作用，未来需阐明上游机制并验证是否存在真正的生物学联合效应。
综上所述，LF和OPN复合蛋白显著减轻了LPS诱导的巨噬细胞炎症反应，明显缓解了LPS诱导肠道损伤造成的肠道屏障破坏，并大幅降低了局部肠道及全身炎症细胞因子水平。联合干预组多项指标显著优于LF组和OPN组，表明LF和OPN之间存在联合效应。然而，其联合抗炎作用的具体机制及LF和OPN实现该效应的特定通路仍需进一步研究。
