碳青霉烯酶基因谱与碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌对头孢他啶–阿维巴坦（CZA）耐药性的关联研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Association of Carbapenemase Gene Profiles with Ceftazidime–avibactam Resistance in Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae

　　

碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）是重大医疗威胁，碳青霉烯酶基因型可能影响头孢他啶–阿维巴坦（CZA）敏感性。该研究评估了CRKP分离株中碳青霉烯酶基因谱与CZA耐药性的关联。在这项回顾性实验室研究中，分析了184株CRKP分离株（92株CZA敏感和92株CZA耐药）。采用多重实时聚合酶链反应（multiplex real-time PCR）检测碳青霉烯酶基因，并按CZA敏感性比较基因分布和基因谱。CZA耐药分离株中NDM检出率为82.6%，而敏感分离株中未检出NDM（q < 0.001）。所有CZA敏感分离株均携带单一碳青霉烯酶基因，而耐药分离株中68.5%携带两个或更多基因。NDM + OXA-48样（OXA-48-like）是耐药分离株中的主要基因谱（63.0%），而OXA-48样单独是敏感分离株中的主要基因谱（92.4%）（均q < 0.001）。NDM区分CZA耐药性的敏感性为82.6%，特异性为100%，曲线下面积（AUC）为0.913。CZA耐药分离株中阿米卡星耐药率也更高（60.9% vs. 31.5%；q < 0.001）。NDM，尤其与OXA-48样共存时，与CZA耐药性强相关。快速碳青霉烯酶基因分型可能补充表型药敏试验，并支持抗菌治疗决策。

研究背景：碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）是重要机会致病菌，可引起菌血症、肺炎、尿路感染和手术部位感染等医院获得性感染。近年来，CRKP传播成为全球健康问题，治疗选择有限且与死亡率增加相关；医院获得性肺炎克雷伯菌感染中碳青霉烯耐药率较高，CRKP感染死亡率约42%。碳青霉烯酶产生是主要耐药机制，但孔蛋白丢失、外膜通透性降低和外排系统亦可能参与。临床相关碳青霉烯酶包括KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48样酶；KPC为丝氨酸β-内酰胺酶，NDM、VIM和IMP为金属β-内酰胺酶（MBLs），OXA-48样酶属D类碳青霉烯酶。头孢他啶–阿维巴坦（CZA）是重要β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合制剂，阿维巴坦对丝氨酸β-内酰胺酶有抑制作用，CZA对产KPC和OXA-48样酶分离株具有较高体外活性；但阿维巴坦不能抑制NDM、VIM和IMP等MBLs，从而明显限制CZA对产MBL分离株的活性。因此，碳青霉烯酶基因型是预测CZA敏感性的重要分子决定因素。然而，CZA耐药不能仅由MBLs解释，KPC变异和影响外膜通透性的孔蛋白改变等亦可能参与，OmpK35/OmpK36和LamB等外膜蛋白改变与耐药表型相关，产OXA-48样酶分离株在CZA暴露后亦可出现不同分子耐药机制。尤其在OXA-48样碳青霉烯酶流行地区，NDM共携带及多碳青霉烯酶基因谱使阐明CZA敏感性与碳青霉烯酶基因型关系具有临床和流行病学重要性。该研究旨在探讨CRKP分离株中CZA敏感性状态与碳青霉烯酶基因型及基因谱的关联。

研究人员开展了一项回顾性实验室研究，纳入184株CRKP分离株（92株CZA敏感、92株CZA耐药），通过多重实时PCR检测碳青霉烯酶基因，并按CZA敏感性比较基因分布、基因数量和基因谱。研究得出，CZA耐药与碳青霉烯酶基因谱明确相关；NDM在CZA耐药分离株中高频率检出且不见于CZA敏感分离株，NDM尤其与OXA-48样共存时与CZA耐药性强相关，而OXA-48样单独更常与CZA敏感相关。NDM对区分CZA耐药具有较高判别性能。该研究提示，快速碳青霉烯酶基因分型可补充表型药敏试验并支持抗菌治疗决策，尤其在OXA-48样碳青霉烯酶流行地区具有分子监测和临床治疗选择意义，但不能替代表型药敏试验。

关键技术方法（≤250字）：研究为单中心回顾性实验室研究，样本队列来源于Ankara Etlik City Hospital医学微生物实验室2023年7月1日至2024年2月1日各种临床标本的184株存档、非重复CRKP分离株，包括92株CZA敏感和92株CZA耐药分离株。采用MALDI Biotyper? Sirius系统进行菌种鉴定；CZA敏感性用纸片扩散法，黏菌素用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），其他抗菌药物用BD Phoenix? M50自动化系统；结果按欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）16.0版（2026）折点回溯判读。采用多重实时PCR检测KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-23/OXA-58、OXA-48和OXA-51基因；按检出基因数量分为单基因和多基因携带，并定义基因谱。统计分析采用SPSS 27.0，包括卡方检验或Fisher精确检验、Mann–Whitney U检验、比值比（OR）及95%置信区间（CI）、Cochran–Mantel–Haenszel（CMH）分层分析和Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）校正。

研究结果：
2.1 根据CZA敏感性状态的碳青霉烯酶基因分布：通过按CZA敏感性分组比较多重实时PCR检出率，所有分离株至少检出一种目标碳青霉烯酶基因。CZA敏感组中OXA-48样最常见，为85/92（92.4%），KPC为7/92（7.6%），NDM、OXA-23/58、OXA-51、IMP和VIM未检出。CZA耐药组中NDM为76/92（82.6%），OXA-48样为74/92（80.4%），KPC为6/92（6.5%），OXA-23/58为1/92（1.1%），OXA-51、IMP和VIM未检出。NDM在CZA耐药组显著更常见（82.6% vs. 0%；p < 0.001），FDR校正后q < 0.001；OXA-48样在CZA敏感组更常见（92.4% vs. 80.4%；p = 0.030），但FDR校正后q = 0.060；KPC阳性率组间无显著差异（7.6% vs. 6.5%；p = 1.000）。结论为NDM与CZA耐药密切相关。

2.2 碳青霉烯酶基因数量及基因谱与CZA耐药性的关联：通过比较单基因和多基因携带及具体基因组合，所有CZA敏感分离株均携带单一碳青霉烯酶基因，未检出多基因携带；CZA耐药株中单基因29/92（31.5%），两个或以上基因63/92（68.5%），其中两基因61株（66.3%）、三基因2株（2.2%）。基因谱方面，OXA-48样单独在CZA敏感组最常见[85/92（92.4%）]，NDM + OXA-48样在CZA耐药组最常见[58/92（63.0%）]；NDM单独见于13/92（14.1%）CZA耐药株，未见于敏感株；NDM + KPC见于3株（3.3%）耐药株，NDM + OXA-48样 + KPC及NDM + OXA-48样 + OXA-23/58各1株（1.1%）。FDR校正后，OXA-48样单独、NDM单独和NDM + OXA-48样基因谱仍具统计学意义（均q < 0.001）。结论为多碳青霉烯酶基因共现及NDM + OXA-48样谱与CZA耐药相关。

2.3 碳青霉烯酶基因预测CZA耐药性的性能：通过计算NDM及联合基因面板的预测性能，NDM预测CZA耐药的敏感性为82.6%（95% CI：73.3–89.7），特异性为100.0%（95% CI：96.1–100.0），阳性预测值（PPV）为100.0%（95% CI：95.3–100.0），阴性预测值（NPV）为85.2%（95% CI：77.1–91.3），AUC为0.913。NDM阳性分离株中78.9%（60/76）同时OXA-48样阳性；按NDM状态分层后，NDM阴性分离株（n = 108）中OXA-48样与CZA耐药无显著关联（OR = 0.576），NDM阳性分离株均CZA耐药而无法估计层特异OR，CMH分析显示OXA-48样与CZA耐药无显著关联（共同OR = 0.576；CMH p = 0.515）。联合面板中，NDM或KPC阳性时敏感性84.8%、特异性92.4%、PPV 91.8%、NPV 85.9%；NDM或OXA-48样阳性时敏感性97.8%、特异性7.6%、PPV 51.4%、NPV 77.8%。结论为NDM对CZA耐药具有较高判别性能，联合面板会改变敏感性和特异性。

2.4 根据CZA敏感性状态的阿米卡星和黏菌素敏感性：通过比较CZA敏感与耐药组的阿米卡星和黏菌素药敏结果，所有CZA耐药分离株均对碳青霉烯类、头孢菌素类、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合制剂和氟喹诺酮类耐药，部分分离株保留阿米卡星和黏菌素敏感性。CZA耐药组阿米卡星耐药率为60.9%（56/92），CZA敏感组为31.5%（29/92），组间差异显著（p < 0.001），FDR校正后q < 0.001。黏菌素耐药在CZA耐药组为33/92（35.9%），敏感组为20/92（21.7%），未校正p = 0.050，FDR校正后q = 0.050，未达到q < 0.05阈值；184株黏菌素MIC中位数为2 μg/mL（四分位距[IQR]：1–4），CZA敏感组和耐药组中位MIC均为2 μg/mL（IQR分别为1–2和1–8），两组黏菌素MIC分布无显著差异（p = 0.084）。结论为CZA耐药组阿米卡星耐药率更高，黏菌素耐药及MIC分布差异未达显著。

讨论部分总结：该研究显示CZA耐药与CRKP碳青霉烯酶基因型明确相关，NDM在CZA耐药株中高频率检出且不见于CZA敏感株；所有CZA敏感株携带单一碳青霉烯酶基因，而约三分之二耐药株携带多个基因，NDM + OXA-48样为耐药组最常见基因谱，OXA-48样单独更常与CZA敏感相关。NDM与CZA耐药的关联与阿维巴坦对MBLs活性有限一致；Zhang et al.报告CZA耐药CRKP中53.1%存在MBLs，并提示MBL产生可能显著参与CZA耐药。多基因共现尤其在OXA-48样流行地区值得关注，NDM + OXA-48样为携带两种碳青霉烯酶CRKP中最常见组合。OXA-48样单独与CZA敏感相关，但OXA-48样单独存在不保证CZA敏感，仍可能有其他β-内酰胺酶改变、通透性缺陷等机制。该研究进一步按NDM状态分层分析OXA-48样与CZA耐药关联，指出OXA-48样单独基因谱分析与NDM分层后总体OXA-48样阳性分析暴露定义和比较组不同，结果不矛盾。KPC在两组频率相近，提示KPC单独不足以解释CZA耐药表型；KPC变异涉及Ω环区、bla_KPC拷贝数或表达增加及孔蛋白改变等机制可能参与，但研究未进行靶向测序、全基因组测序、基因表达和孔蛋白分析，故不能确认。阿米卡星耐药在CZA耐药组更高，与携带多碳青霉烯酶CRKP常具氨基糖苷类等额外耐药一致；黏菌素结果应谨慎解释，CZA耐药或特定碳青霉烯酶谱本身不足以预测黏菌素耐药，黏菌素敏感性应通过表型方法单独评估。分子碳青霉烯酶分型不能替代表型药敏试验，但与表型结果联合解读可支持抗菌治疗选择，尤其考虑经验性或早期靶向使用CZA时。局限包括单中心存档分离株、等比例纳入CZA敏感和耐药株使PPV和NPV反映选择人群而不能直接外推至不同CZA耐药率临床环境；未评估碳青霉烯酶变异、基因表达和拷贝数变化、孔蛋白改变、外排机制及其他CZA耐药决定因素；未评估临床结局。

研究结论翻译：总之，该研究证明CRKP分离株中CZA耐药与碳青霉烯酶基因谱明确相关。NDM的存在，尤其NDM + OXA-48样组合，与CZA耐药性强相关，而OXA-48样单独基因谱更常与CZA敏感相关。这些发现提示，碳青霉烯酶基因谱可能有助于预测CZA敏感表型，尤其在OXA-48样碳青霉烯酶流行地区。将快速分子碳青霉烯酶分型与表型抗菌药物敏感性试验结合使用，可能支持分子监测和适当抗菌治疗选择。