《International Journal of Molecular Sciences》：Aluminum Chloride-Induced Planarian Model with Cognitive Impairments Through Neuronal Damage, Neurotransmitter Imbalance, Apoptosis, and Oxidative Stress
编辑推荐：
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的患病率显著上升，这将给家庭和社会带来沉重负担。认知障碍是阿尔茨海默病的典型特征。啮齿类动物模型在AD研究中发挥关键作用，但其高昂的成本和缓慢的发育进程对治疗发现的步伐构成挑战。本研究利用AlCl3
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的患病率显著上升，这将给家庭和社会带来沉重负担。认知障碍是阿尔茨海默病的典型特征。啮齿类动物模型在AD研究中发挥关键作用，但其高昂的成本和缓慢的发育进程对治疗发现的步伐构成挑战。本研究利用AlCl3建立了一种新的涡虫认知功能障碍模型。经50 μM AlCl3暴露48 h后，涡虫在趋光性测试、双刺激决策测试和T迷宫测试中表现出认知功能障碍。免疫组织化学和免疫荧光实验证实AlCl3损伤了涡虫的神经结构。此外，AlCl3破坏了神经递质的平衡，导致细胞凋亡和氧化应激。最后，研究人员证实多奈哌齐（donepezil）可减轻AlCl3引起的认知障碍。这表明所建立的涡虫认知功能障碍模型是可行的。然而，涡虫缺乏AD典型的淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）斑块和tau蛋白神经原纤维缠结。因此，涡虫模型可被视为用于认知障碍候选药物高通量筛选的有前景的补充平台。
论文解读：氯化铝诱导涡虫认知障碍模型的建立与机制研究
一、研究背景与意义
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种神经退行性疾病，认知功能下降是其典型特征。除典型的老年斑中淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）沉积和神经原纤维缠结中过度磷酸化tau蛋白外，氧化应激和神经炎症也参与AD的发病机制。导致AD的三大因素是年龄、遗传和家族史，其中年龄是最大的风险因素。全球已进入老龄化社会，AD患病率显著增加，预计到2050年全球AD患者数量将达到1.3亿，这将给家庭和整个社会带来沉重负担。由于AD病因复杂且尚未完全阐明，目前获批的药物如多奈哌齐（donepezil）仅能改善部分AD症状，无法阻止疾病进展。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的仑卡奈单抗（Lecanemab）和阿杜那单抗（Aducanumab）靶向Aβ沉积，在AD早期显示出一定疗效，但治疗成本相对较高。因此，AD的治疗仍是一个未解难题。
啮齿类动物模型在AD研究中发挥关键作用，提供了深入的机制见解，但其高昂的成本和缓慢的发育进程对治疗发现的步伐构成挑战。斑马鱼模型、黑腹果蝇模型和秀丽隐杆线虫模型在一定程度上缓解了这一问题。然而，仍然迫切需要成本效益高、支持高通量筛选并能快速识别具有治疗前景的化合物的替代AD模型。
涡虫是自由生活的扁形动物，具有真正突触传递的中枢化大脑，并共享脊椎动物大脑中大多数神经递质。涡虫在斑马鱼和线虫之间占据中间位置。涡虫表现出显著的再生能力，是研究再生的理想模型。作为水生扁虫，涡虫能快速响应外部环境，已成为有毒物质检测和神经毒理学研究的模式生物。此外，已有报道表明涡虫具有认知功能，表现出趋光性、趋热性和决策等多种行为。涡虫能通过整合大脑中的多种外部信号来调整行为特征以适应刺激条件。涡虫价格低廉、繁殖迅速、适合高通量筛选，这些特性使其成为认知障碍靶向化合物初步筛选的有用补充系统。
铝（Al）在工业和日常生活中广泛使用，可通过水和食物轻易进入人体。铝进入体内后可引发一系列不良效应，尤其对神经系统影响显著。尽管铝是否直接导致AD存在争议，但AlCl3已被用作大鼠和斑马鱼认知障碍及AD相关神经病理变化的实验诱导剂，并广泛应用于AD研究。
为克服啮齿类AD模型的部分缺点，研究人员尝试利用AlCl3建立新的涡虫认知障碍模型，并验证其作为认知障碍候选药物高通量筛选补充平台的可行性。
二、主要关键技术方法
研究人员利用AlCl3（购自上海麦克林生化科技有限公司）建立涡虫认知障碍模型。涡虫（Dugesia ZB）由山东理工大学的徐振彪教授提供，在22 ℃恒温、湿度70%~80%条件下以脱氯水饲养，以新鲜牛肝为食。选取8–10 mm长的涡虫，实验前饥饿7天。采用XR-Fish2软件记录涡虫运动轨迹，开展趋光性测试、双刺激决策测试和T迷宫测试评估认知功能；采用苏木精-伊红（HE）染色、尼氏染色、抗突触蛋白（anti-SYNORF1）免疫荧光、5-羟色胺（5-HT）神经元特异性抗体（anti-SERT）染色和TUNEL凋亡染色观察神经结构损伤；利用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测乙酰胆碱（ACh）、5-HT、γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸（Glu）含量；检测caspase-3、caspase-7、caspase-8活性评估细胞凋亡；检测过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性和丙二醛（MDA）含量评估氧化应激。最后采用多奈哌齐（7 μM）进行干预验证模型可行性。
三、研究结果
3.1 AlCl3损伤涡虫的存活状态
研究人员根据文献建立了涡虫状态评分标准。随着AlCl3浓度从0增加到200 μM并持续48 h，涡虫表现出更严重的毒性。在低于100 μM的浓度下，AlCl3在48 h内对涡虫状态无显著影响；但在200 μM浓度下，涡虫评分显著下降，呈现明显的C形形态但48 h内未死亡。400、800和1000 μM的更高浓度毒性进一步增强。这表明高于100 μM的浓度对涡虫的毒性效应过于严重，不适合用于涡虫神经功能损伤研究。
3.2 AlCl3损害涡虫的认知功能
研究人员在0至100 μM范围内设置四组，开展T迷宫测试。涡虫暴露于100 μM AlCl3 12、24和48 h后，总运动距离显著减少，而其他浓度组无显著变化。因此选择对运动能力无影响的最高浓度50 μM进行后续测试。涡虫进入摄食区（FC）的潜伏期在12 h和24 h无显著差异，但在48 h显著延长；在FC区域停留时间和进入FC区域的次数在48 h显著缩短和减少。结果表明50 μM AlCl3暴露48 h损害了涡虫的学习和记忆能力。
趋光性测试中，涡虫具有避开强光、表现负趋光性的自然倾向。暴露于50 μM AlCl3 48 h后，涡虫总运动距离显著增加，进入暗室的潜伏期无差异，在亮场停留时间显著延长，进入暗区的次数显著增加。结果表明50 μM AlCl3暴露48 h损害了涡虫的被动反应能力。
双刺激决策测试中，光为涡虫厌恶的刺激，食物为涡虫偏好的刺激。暴露于50 μM AlCl3 48 h后，涡虫总运动距离显著减少，进入暗区的潜伏期显著延长，在亮场停留时间和进入暗室次数显著增加。结果表明50 μM AlCl3暴露48 h损害了涡虫的决策行为。
3.3 AlCl3损伤涡虫的神经系统
选取涡虫头部中间组织进行HE染色。正常条件下，涡虫组织细胞大小和形态正常，细胞核大而圆，结构清晰可见。暴露于50 μM AlCl3 48 h后，细胞排列紊乱并出现不同程度的固缩，表明AlCl3引起涡虫炎症反应。尼氏染色显示健康条件下尼氏体体积大且呈紫蓝色，而暴露后紫蓝色变浅、尼氏体数量减少，平均光密度（AOD）显著降低，证明50 μM AlCl3损伤神经元。抗突触蛋白（anti-SYNORF1）染色显示涡虫中枢神经系统（CNS）由一对脑神经节和两条贯穿全身的腹神经索组成，神经索通过短神经连接相互连接。暴露后SYNORF1免疫阳性神经元的荧光强度和神经纤维密度减弱和降低，证明AlCl3损伤了涡虫的神经结构。5-HT特异性抗体染色显示暴露后涡虫绿色荧光强度显著增加。TUNEL凋亡染色显示暴露于50 μM AlCl3 48 h导致涡虫出现严重细胞凋亡。
3.4 AlCl3诱导涡虫神经递质失衡
研究人员测量了与认知功能密切相关的ACh、5-HT、GABA和Glu含量。暴露于AlCl3后，神经递质含量在36、48和60 h出现显著波动。ACh在36 h无差异、48 h显著增加、60 h显著减少；5-HT在36 h显著减少、48 h显著增加、60 h无差异；GABA在36 h和60 h显著减少、48 h显著增加；Glu在36、48和60 h均显著减少。结果表明AlCl3诱导神经递质失衡从而损害认知功能。
3.5 AlCl3引起涡虫细胞凋亡
TUNEL染色证实AlCl3可促进涡虫细胞凋亡。同时，暴露于AlCl3后，caspase-3、caspase-7和caspase-8的活性显著升高。凋亡相关酶活性的增加导致细胞凋亡，进而破坏涡虫全身细胞，包括神经细胞。
3.6 AlCl3诱导涡虫氧化应激
暴露于50 μM AlCl3 48 h后，CAT活性显著下降，SOD活性无差异，GST活性和MDA含量显著增加。结果表明AlCl3加剧了涡虫的氧化应激，导致细胞损伤和脂质过氧化。
3.7 多奈哌齐减轻AlCl3引起的涡虫认知障碍
研究人员选用7 μM多奈哌齐作为最佳给药浓度。在三种行为测试中，涡虫总运动距离均无差异。模型组（Mod）的潜伏期显著延长，而多奈哌齐治疗组显著缩短。趋光性测试中，Mod组在亮场停留时间和进入暗区次数显著增加，多奈哌齐治疗后呈下降趋势。双刺激决策测试中，多奈哌齐显著减少了亮场停留时间和进入暗区次数。T迷宫测试中，多奈哌齐逆转了涡虫在摄食区停留时间和访问次数的下降趋势。结果表明多奈哌齐减轻了AlCl3引起的涡虫认知障碍。
四、讨论与结论
本研究建立了AlCl3诱导的涡虫认知功能障碍新模型。通过趋光性测试、双刺激决策测试和T迷宫测试的行为学研究，证实涡虫认知功能受损；免疫组织化学和免疫荧光实验证实AlCl3损伤涡虫神经结构；AlCl3破坏神经递质平衡，导致细胞凋亡和氧化应激；多奈哌齐可减轻AlCl3引起的涡虫认知障碍。然而，该模型仅再现AD的部分病理和行为特征，涡虫作为无脊椎动物缺乏AD标志性的Aβ斑块和tau神经原纤维缠结，其神经系统比哺乳动物简单得多，不具有真正的血脑屏障或哺乳动物样的药代动力学和代谢特征，且涡虫表现出的趋光性、决策和T迷宫学习行为仅代表有限的认知样功能。因此，涡虫模型应被视为识别可能减轻认知障碍化合物的补充性高通量筛选工具，在该模型中获得的研究结果需要在哺乳动物模型和临床研究中进一步验证。综上所述，研究人员建立了AlCl3诱导的涡虫认知功能障碍新模型。AlCl3损害了涡虫的认知功能，损伤了其神经结构，破坏了神经递质的平衡，并加剧了细胞凋亡和氧化应激。然而，该模型仅再现阿尔茨海默病的部分病理表型。因此，涡虫模型可被视为用于认知障碍候选药物高通量筛选的有前景的补充平台。
