《Pharmaceuticals》：Nelfinavir Synergizes with Cisplatin and Promotes GSDME-Associated Lytic Cell Death in Platinum-Resistant Ovarian Cancer Cells
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背景/目的：铂类药物耐药限制了卵巢癌治疗的疗效，其产生机制多样，包括DNA修复增强、应激反应激活和生存信号通路上调。奈非那韦是一种具有抗肿瘤活性的HIV蛋白酶抑制剂，是药物重定位的候选药物，但其与顺铂在卵巢癌中的相互作用尚未明确。本研究旨在探究奈非那韦是否能增
背景/目的：铂类药物耐药限制了卵巢癌治疗的疗效，其产生机制多样，包括DNA修复增强、应激反应激活和生存信号通路上调。奈非那韦是一种具有抗肿瘤活性的HIV蛋白酶抑制剂，是药物重定位的候选药物，但其与顺铂在卵巢癌中的相互作用尚未明确。本研究旨在探究奈非那韦是否能增强顺铂在铂耐药卵巢癌细胞中的细胞毒性，并阐明相关的细胞死亡特征。方法：采用细胞活力和存活率检测、Loewe相加模型以及Bliss和ZIP分析评估药物相互作用。通过Annexin V/7-AAD染色、线粒体膜电位分析、乳酸脱氢酶释放、免疫印迹、药理学半胱天冬酶抑制以及差异表达分析和基因集富集分析的批量mRNA测序来表征细胞死亡。结果：奈非那韦在三株铂耐药卵巢癌细胞系中均协同增强了顺铂的细胞毒性，使顺铂IC50值降低4.2至5.8倍，平均Loewe协同得分约为25至30。联合治疗增加了乳酸脱氢酶释放，并伴随半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-3、PARP以及成孔效应蛋白gasdermin E的剪切。半胱天冬酶抑制减弱了活力丧失和GSDME加工。转录组学分析鉴定出应激和死亡相关程序的富集，包括未折叠蛋白反应、凋亡、活性氧相关信号传导以及TNF/NF-κB信号传导。结论：这些发现共同证明了在铂耐药卵巢癌细胞中，顺铂与奈非那韦之间存在可重复的协同相互作用，并描述了涉及凋亡信号传导并伴随GSDME加工的裂解性细胞死亡表型。这些发现支持进一步研究奈非那韦作为重定位的联合用药伙伴，以增强顺铂在铂耐药卵巢癌中的细胞毒性。
研究背景与意义
卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，由于常在晚期才被诊断且复发率高，临床治疗面临巨大挑战。目前标准治疗方案包括肿瘤细胞减灭术联合铂类药物化疗。尽管患者初期对铂类化疗敏感，但大多数最终会发展为复发性铂耐药疾病，这凸显了提升治疗效果策略的迫切需求。铂耐药源于一系列适应性改变网络，包括铂离子转运失调、DNA损伤修复能力增强、应激适应程序激活以及PI3K-Akt等促生存信号通路的参与，同时削弱促死亡信号传导。因此，铂耐药细胞可能耐受大量铂诱导的损伤，却无法有效将这种应激转化为细胞死亡。基于此，寻找能够增强铂类药物细胞毒效应、干扰或克服卵巢癌细胞适应性生存反应的药物具有重要意义。
奈非那韦作为一种HIV蛋白酶抑制剂，因在多种癌症类型中表现出抗肿瘤活性而成为药物重定位候选药物。先前研究表明，奈非那韦可通过涉及未折叠蛋白反应、DNA损伤和促凋亡信号的通路对高级别浆液性卵巢癌细胞发挥细胞毒作用，并能改变Akt和Erk介导的促生存信号。这为探究奈非那韦能否增强铂类药物在卵巢癌细胞中的细胞毒性提供了理论基础。然而，奈非那韦与顺铂在杀伤铂耐药卵巢癌细胞方面是否存在相互作用尚不清楚。
研究内容与结论
本研究中，研究人员证实奈非那韦与顺铂在三株铂耐药卵巢癌细胞系中存在协同细胞毒相互作用。通过在PEO4和IGROV-1/CP细胞中的详细表征，发现联合治疗产生了一种裂解性细胞死亡表型，其特征为Annexin V/7-AAD阳性、半胱天冬酶-3和PARP剪切、GSDME加工、乳酸脱氢酶释放以及质膜破坏形态学改变。药理学抑制实验进一步支持了半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-3的贡献，并与其活性与GSDME加工之间的关联一致。该应答发生于内质网应激和促凋亡转录改变、Akt相关标志物改变以及DNA损伤相关改变的细胞背景下。这些发现支持一个工作模型，即联合顺铂/奈非那韦处理激活了半胱天冬酶相关信号，并伴随GSDME加工和裂解性细胞死亡表型，但这些事件的具体分子需求和时序仍有待确定。
主要关键技术方法
研究采用了多种技术方法。细胞模型方面，使用了三株铂耐药卵巢癌细胞系：源自铂耐药患者的PEO4细胞、体外慢性顺铂暴露产生的IGROV-1/CP细胞以及内在铂耐药的TOV21G细胞。药物相互作用评估采用Loewe相加模型结合Bliss和ZIP分析。细胞死亡表征通过Annexin V/7-AAD微毛细管流式细胞术、线粒体膜电位分析、乳酸脱氢酶释放检测、免疫印迹以及药理学半胱天冬酶抑制实现。转录组分析则通过对IGROV-1/CP细胞进行批量mRNA测序，并进行差异表达分析和基因集富集分析。
研究结果
2.1 奈非那韦与顺铂在铂耐药卵巢癌细胞中协同降低活力
通过细胞活力检测和Loewe相加模型分析，研究人员发现奈非那韦在三株铂耐药卵巢癌细胞系中均协同增强了顺铂的细胞毒性，使顺铂IC50值降低4.2至5.8倍，平均Loewe协同得分约为25至30。Bliss独立性和ZIP参考模型分析也支持整体协同作用。
2.2 联合顺铂/奈非那韦处理诱导伴随凋亡信号和GSDME加工的裂解性细胞死亡
通过Annexin V/7-AAD染色、明场显微镜观察、乳酸脱氢酶释放检测和免疫印迹分析，研究人员发现联合治疗增加了Annexin V和7-AAD双阳性细胞比例，并观察到肿胀、空泡化等裂解性细胞死亡形态学特征。同时，联合治疗显著增加半胱天冬酶-3、PARP和GSDME的剪切，以及乳酸脱氢酶释放。甘氨酸可显著减少乳酸脱氢酶释放，表明终末质膜破裂参与了该死亡表型。
2.3 联合顺铂/奈非那韦处理与半胱天冬酶-8剪切和线粒体凋亡信号相关
通过免疫印迹和线粒体膜电位分析，研究人员发现联合治疗增加了半胱天冬酶-8剪切和Bid加工，提高了Bax/Bcl-2比值，并导致线粒体内膜去极化细胞比例增加。转录组学分析进一步支持凋亡相关程序的富集。
2.4 药理学半胱天冬酶抑制减弱顺铂/奈非那韦相关的活力丧失和GSDME加工
通过使用特异性抑制剂，研究人员发现抑制半胱天冬酶-3或半胱天冬酶-8均可显著改善联合治疗后的细胞活力，并减少GSDME剪切。而铁死亡抑制剂ferrostatin-1和坏死性凋亡抑制剂necrostatin-1未能挽救细胞活力。
2.5 顺铂与奈非那韦联合与应激和死亡相关转录程序及Akt和DNA损伤相关标志物改变有关
通过RNA测序和免疫印迹分析，研究人员发现联合治疗富集了活性氧、凋亡、未折叠蛋白反应和TNF/NF-κB等应激和死亡相关通路，而下调了糖酵解、脂肪酸代谢和细胞周期相关通路。蛋白水平上，联合治疗增加了CHOP和PUMA表达，降低了磷酸化Akt和磷酸化GSK-3β水平，减少了53BP1丰度，并增加了γH2AX水平。
讨论与结论
本研究发现奈非那韦与顺铂在铂耐药卵巢癌细胞中存在协同细胞毒相互作用，并阐明了相关的裂解性死亡表型。这一发现对于解决卵巢癌治疗中铂耐药这一难题具有重要意义，因为药物重定位策略利用临床可用药物增强铂类衍生物的反应尤为引人关注。联合治疗诱导的死亡应答同时呈现凋亡信号和GSDME加工，其中半胱天冬酶-3既可执行凋亡，也可剪切GSDME形成孔道，从而将凋亡执行与裂解性细胞死亡联系起来。半胱天冬酶-8也在此过程中发挥重要作用，可能通过Bid加工放大线粒体凋亡途径。此外，即使在p53突变背景下，联合治疗仍能激活p53样促凋亡转录程序，这可能归因于内质网应激相关的CHOP活性。研究还观察到Akt信号和DNA损伤相关标志物的改变。
研究结论：这些发现共同证明了在铂耐药卵巢癌细胞模型中，奈非那韦与顺铂之间存在可重复的协同细胞毒相互作用，并鉴定出一种涉及半胱天冬酶-8/半胱天冬酶-3信号和GSDME加工的裂解性死亡表型。这些数据为进一步的遗传学、时间分辨和药理学评估奠定了基础，并支持将奈非那韦作为重定位的联合用药伙伴以增强顺铂在铂耐药卵巢癌中细胞毒性的进一步临床前研究。
