雄性Wistar大鼠中可待因与十一酸睾酮联合给药期间全血可待因及血浆总睾酮浓度模式的探索性研究

《Pharmaceuticals》：Codeine and Testosterone Concentration Patterns During Co-Administration of Codeine and Testosterone Undecanoate in Male Wistar Rats

　　

背景：三个间隔较远的采样日无法建立常规药代动力学（pharmacokinetic, PK）参数。因此，研究人员检查了雄性Wistar大鼠中可待因与十一酸睾酮联合给药期间探索性全血可待因和血浆总睾酮浓度模式。方法：三十二只大鼠被分配至生理盐水（S）、可待因（C）、十一酸睾酮（T）或可待因联合十一酸睾酮（CT）组（每组八只）。可待因（10 mg/kg，经口灌胃）从第0天至第5天每日一次（共六剂），十一酸睾酮（100 mg/kg，肌内注射）于第3天给药。第0天，可待因给药后两小时采集全血；因此，第0天是给药后采样点而非给药前基线。第6天未给予可待因；第6天样本在六剂治疗方案完成后采集。可待因剂量体积根据每只大鼠基线体重调整。因样本体积不足而无法获得的测量值按缺失处理，未进行插补。可待因仅在C和CT组定量；因此相应模型估计的是在可待因治疗动物中加入十一酸睾酮的关联，而非完整的析因药物–药物相互作用（drug–drug interaction, DDI）。结果：所有14份可用的第0天样本均有仪器报告的全血可待因浓度（范围0.339–4.705 ng/mL），与其给药后状态一致。使用所有仪器报告值的C对CT组×日检验得到Wald卡方=8.487（df=2，p=0.014）。以经验证的定量下限（lower limit of quantification, LOQ）0.25 ng/mL计，仅CT7第14天（0.08 ng/mL）低于LOQ但仍高于检测下限（limit of detection, LOD）0.07 ng/mL；排除该观测值后得到Wald卡方=7.856（df=2，p=0.020）。血浆总睾酮可获得性随组和日变化（n=3–8）；原始尺度组×日检验p=0.0076，而对数尺度敏感性检验p=0.052。结论：观察到的数值模式为探索性。稀疏采样、一个低于LOQ的可待因值、一个有影响力的CT7观测值、血浆总睾酮可获得性不等，以及对分析和建模选择的敏感性，妨碍得出因果、药代动力学、代谢、内分泌机制或临床结论。

研究背景与问题：可待因（codeine）为弱阿片类药物，其活性与安全性依赖生物转化。细胞色素P450 2D6（cytochrome P450 2D6, CYP2D6）介导的O-去甲基化生成吗啡，CYP3A4介导的N-去甲基化生成去甲可待因，UDP-葡萄糖醛酸转移酶2B7（uridine diphosphate glucuronosyltransferase 2B7, UGT2B7）介导的葡萄糖醛酸化生成可待因-6-葡萄糖醛酸苷；这些竞争通路造成母药和代谢物谱的显著变异，仅母药浓度不能识别哪条代谢通路发生变化。十一酸睾酮（testosterone undecanoate, TU）的肌内暴露特征依赖制剂；大鼠25 mg/kg制剂研究显示粒径和制剂可导致暴露差异，本研究使用商品油剂并与盐水手工混合，不能假定与其他TU制剂暴露等效。体外研究报告睾酮竞争性抑制人UGT2B7，K_i在重组系统中为11.4 μmol/L、在混合人肝微粒体中为30.2 μmol/L；但该研究未测试TU、可待因、大鼠或体内相互作用，作者认为在常规循环睾酮浓度下系统性肝调制不太可能，因此仅支持可检验假设。既往雄性Wistar大鼠研究使用肌内TU 100 mg/kg，包括每日给药一周和单剂Nebido方案；小鼠研究报道Nebido以0.9% NaCl稀释后肌内给药；这些报道提供剂量、途径和盐水稀释的实验先例，但不确立暴露可比性，也未验证本研究的准确制剂比例；100 mg/kg为极高实验暴露，不应解释为与临床替代方案等效。阿片暴露可抑制下丘脑–垂体–性腺轴（hypothalamic–pituitary–gonadal axis, HPG），系统综述和meta分析发现慢性阿片治疗以男性为主人群中常见性腺轴抑制；这些临床数据不能确立大鼠短期可待因暴露的内分泌效应，但为同时测量全血可待因和血浆总睾酮提供理由。本研究的探索性问题是可用全血可待因和血浆总睾酮浓度模式是否在不同治疗组和三个采样日不同。由于未测量LH、FSH、雌二醇、代谢物、UGT活性和常规PK参数，该研究不能确立内分泌轴抑制、代谢竞争或PK DDI。

研究人员开展的研究与结论意义：研究人员将32只雄性Wistar大鼠分为S、C、T、CT四组（每组8只），C组10 mg/kg经口灌胃第0–5天共6剂，TU 100 mg/kg第3天肌内注射；第0天可待因后2小时采集全血，第6天未给予可待因并在六剂完成后采样，第14天终末心内采血；全血可待因采用液相色谱–串联质谱（liquid chromatography–tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）测定，血浆总睾酮采用MAGLUMI化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay, CLIA）测定；统计分析采用最大似然线性混合效应模型、Wald卡方、Holm校正和敏感性分析。研究结论为探索性浓度模式，不能确立治疗效应或DDI；其意义在于揭示稀疏采样、缺失、制剂和分析选择对推断的限制，并强调后续需完整批级分析文档、经验证制剂、匹配载体和处理对照、前瞻性样本量、密集母药和代谢物采样、直接机制测量、考虑笼效应设计以及两性实验。

关键技术方法（不超过250字）：雄性Wistar大鼠32只（8–12周，DEKAM来源，Erciyes University HADYEK批准23/080），四组S/C/T/CT各8只；C 10 mg/kg经口灌胃第0–5天共6剂，TU 100 mg/kg第3天肌内注射；第0/6/14天采样，第14天终末心内采血；全血可待因LC-MS/MS，血浆总睾酮MAGLUMI CLIA；最大似然线性混合效应模型、Wald卡方、Holm校正及敏感性分析。

研究结果：

2.1 动物处置、分析可获得性与可解释性：通过处置和样本可获得性分析，32只动物全部完成方案，无死亡、不良事件或研究排除；因样本体积不足，部分分析不能进行；全血可待因仅在C和CT组的2–8号动物有测量值（每组每日n=7），C1和CT1无测量值；14份可用第0天样本均有仪器报告数值（0.339–4.705 ng/mL），因采于可待因给药后2小时，属给药后观察而非给药前或基线信号；样本标识检查未发现仪器携带、污染或换样证据；血浆总睾酮第0/6/14天可获得性为S 7/3/8、C 4/5/8、T 6/3/8、CT 5/6/8，缺失未归零或插补，现有记录不足以确立可忽略缺失机制。结论：分析可获得性不均衡，解释受限。

2.2 体重：通过体重分析，初始记录体重225–328 g，基线体重无显著组间差异（F(3,28)=1.182，p=0.334），第14天体重亦无差异（F(3,28)=0.685，p=0.569），但第14天方差异质性被检出（中位数中心化Levene p=0.034）；体重变化组间差异有统计学意义（F(3,28)=5.158，p=0.0058，η²=0.356）；探索性合并误差两两比较经Holm校正后，仅C对T显著（差异=11.875 g，Holm p=0.012，Hedges g=1.70）。结论：体重变化在C与T间不同，属探索性结果。

2.3 纵向全血可待因浓度：通过C与CT的混合效应模型分析三天数值浓度模式，估计在可待因治疗动物中加入TU的关联，而非完整2×2析因DDI；使用所有仪器报告值，名义组×日Wald卡方=8.487（df=2，p=0.014）；以校正LOQ 0.25 ng/mL计，仅CT7第14天0.08 ng/mL低于LOQ但高于LOD 0.07 ng/mL，排除该观测后卡方=7.856（p=0.020）；这些分析不能确立曲线下面积（area under the curve, AUC）、清除率、峰浓度（C_max）、达峰时间（T_max）、半衰期或PK DDI差异；Holm校正CT减C对比仅第6天显著（差异=3.027 ng/mL，95% CI 0.732–5.323；raw p=0.0097，Holm p=0.029），第6天对第0天变化差异对比为3.585 ng/mL（95% CI 0.339–6.831；raw p=0.030，Holm p=0.061）；CT7第6天全血可待因14.067 ng/mL，同批双份复测确认升高；纳入CT7时交互p=0.014，去除CT7第6天观测p=0.033，去除全部三个CT7观测p=0.053。结论：名义模式对单个低于LOQ值和CT7有影响力观测敏感，仍属探索性。

2.4 血浆总睾酮浓度：通过四组血浆总睾酮分析，可用病例原始尺度组×日Wald卡方=17.514（df=6，p=0.0076），对数尺度敏感性检验卡方=12.476（p=0.052）；18个血浆睾酮观测低于100 pg/mL，替换为100 pg/mL后卡方=18.511（p=0.0051），替换为0.07 ng/mL后卡方=17.941（p=0.0064）；原始尺度名义结果在两种替换规则下保留，但对数尺度结果跨过0.05阈值；随机截距估计处于或接近边界；可获得性明显不等，尤其第6天，缺失机制无法确立；这些分析仅描述血浆总睾酮浓度模式，不证明HPG轴抑制或其他内分泌机制。原始尺度Holm校正变化差异对比 versus S：C在第14天对第0天为?330.97 pg/mL（95% CI ?527.97至?133.97；Holm p=0.006），T为?257.17 pg/mL（95% CI ?440.72至?73.61；Holm p=0.030）；第6天和CT对S对比经校正后不显著；这些对比不能推翻对数尺度敏感性结果。结论：数值下降但统计推断尺度敏感、第6天样本量小且缺失不等，不能作机制结论。

讨论部分总结：全血可待因数据提供三个间隔较远采样日的仪器报告数值模式，而非常规PK谱；第0天为可待因给药后2小时采样，属给药后观察；样本标识检查及可用实验室记录未发现仪器携带、污染或换样证据；经验证分析方法的大鼠全血校准范围为3.25–30 ng/mL，LOD为0.07 ng/mL，LOQ为0.25 ng/mL，低于LOQ但高于最低校准品的浓度仅在色谱峰完整性和信噪比满足要求时通过向下外推估算；未测量暴露、清除率和代谢物，母药值单独不能识别CYP或UGT依赖通路是否改变，因此不能证明PK相互作用或UGT介导机制。名义可待因结果对单个低于LOQ观测和CT7敏感：排除CT7第14天0.08 ng/mL后交互p由0.014变为0.020；CT7第6天升高值经同批双份复测确认；纳入CT7时p=0.014，去除该第6天观测p=0.033，去除全部CT7观测p=0.053。血浆总睾酮在各组数值下降，但统计推断尺度敏感、第6天样本量小、数据缺失不等；将低于100 pg/mL值替换为100或70 pg/mL后原始尺度名义组×日交互仍显著，但对数尺度敏感性分析p=0.052；未评估LH、FSH、雌二醇、皮质酮和ACTH，不能区分阿片介导下丘脑–垂体抑制、雄激素反馈、外周芳香化和操作应激。MAGLUMI睾酮测定基于睾酮化学结构在哺乳动物中高度保守及既往雄性大鼠应用，但该测定商业预期为人血清，本研究未在大鼠血浆进行正式物种或基质特异性分析验证，存在未表征基质效应和低于报告限观测，因此睾酮结果应解释为探索性相对趋势而非内分泌干扰的确定证据或完全验证的绝对浓度。TU制剂影响暴露；100 mg/kg为极高实验暴露，不等同临床Nebido给药或睾酮替代剂量；商品油剂与盐水手工混合未进行相容性、相均匀性、稳定性或递送剂量测试，动物间实际暴露均匀性不能确立。体外UGT研究仅支持机制合理性，其使用睾酮而非TU、人系统而非大鼠、探针底物而非可待因，本研究不能将浓度模式与报道的K_i值联系。局限性包括小样本、仅雄性、三个时点、无前瞻性功效计算记录、未验证油–盐水载体、口服和肌内处理不匹配、未建模笼聚集、未测关键机制生物标志物（LH、FSH、雌二醇、代谢物和酶动力学）；统计上存在因样本体积不足导致的不等且可能非忽略缺失、尺度敏感推断、边界随机效应估计及CT7有影响力观测；分析上缺乏大鼠血浆物种和基质特异性验证，且存在低于报告下限的观测，限制分析准确性信心。

研究结论翻译：所提供的数据显示雄性Wistar大鼠探索性全血可待因和血浆总睾酮浓度模式。由于采样稀疏、一个可待因值低于经验证LOQ、CT7尽管双份复测确认仍有影响力、血浆总睾酮可获得性不等，以及制剂和控制匹配局限仍存在，这些数据不能确立治疗效应或药物–药物相互作用。第0天采样发生于可待因给药后两小时，因此代表给药后观察而非给药前基线；第6天未给予可待因，第6天样本在六剂方案完成后、第5天末次给药后采集。该研究不支持关于总暴露、常规药代动力学、UGT竞争、内分泌轴抑制或临床后果的结论。确认需完整的批级分析文档、经验证的制剂、匹配的载体和处理对照、前瞻性论证的样本量、密集的母药和代谢物采样、直接机制测量、考虑笼效应的设计以及两性实验。