《Antibiotics》：PCR-Based Screening for mcr-7, mcr-8, and mcr-9 in Acinetobacter baumannii–Acinetobacter calcoaceticus Complex Isolates from Veterinary and Environmental Sources
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背景/目的： 鲍曼不动杆菌-醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter baumannii–calcoaceticus，Acb）复合群是一类机会性病原体，因其获得多重耐药的能力，在人类医学和兽医医学中的重要性日益增加。黏菌素（colistin）是
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背景/目的： 鲍曼不动杆菌-醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter baumannii–calcoaceticus，Acb）复合群是一类机会性病原体，因其获得多重耐药的能力，在人类医学和兽医医学中的重要性日益增加。黏菌素（colistin）是治疗碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant A. baumannii，CRAB）的最后防线抗菌药物之一，然而其疗效正日益受到耐药决定因子出现的挑战，其中包括由 mobilized colistin resistance（mcr）基因家族编码的耐药机制。本研究旨在筛查从巴西里约热内卢州动物及环境来源中分离的Acb复合群分离株中的mcr基因。方法： 研究人员对2018年至2020年间从犬、猫、马及土壤中获得的35株分离株，采用多重PCR（multiplex PCR）进行基因型鉴定。其中，23株成功复苏的分离株通过多重PCR筛查了mcr变异体（mcr-1至mcr-9）。结果： 5株分离株（21.7%）产生了与mcr相关决定因子存在一致的预期大小扩增子，其中2株与mcr-7一致，1株与mcr-8一致，2株与mcr-9一致。由于未进行扩增子测序和表型黏菌素药敏试验，这些发现应被解读为初步的分子筛查结果。结论： 这些发现表明，在动物和环境来源的分离株中存在可通过PCR检测的mcr相关遗传靶标，凸显了在“One Health”框架下开展进一步分子表征和综合监测的必要性。
论文解读文章
一、研究背景与目的
不动杆菌属（Acinetobacter）是广泛存在于自然界中的革兰阴性、非发酵性球杆菌，在人类医学和兽医医学中日益被视为机会性病原体。其中，鲍曼不动杆菌-醋酸钙不动杆菌复合群（Acinetobacter baumannii–calcoaceticus，Acb复合群）涵盖鲍曼不动杆菌（A. baumannii）、醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）、皮特不动杆菌（A. pittii）和医院不动杆菌（A. nosocomialis），因能在医疗环境中持续存在并具有惊人的多重耐药获得能力而备受关注。世界卫生组织（WHO）已将鲍曼不动杆菌列为“关键优先病原体”，凸显了针对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant A. baumannii，CRAB）感染制定新型治疗和监测策略的紧迫性。
碳青霉烯类药物被视为治疗多重耐药革兰阴性菌感染的最后防线抗菌药物，而黏菌素（colistin，多黏菌素E）作为环状多肽类抗生素，因全球多重耐药感染的上升而重新成为CRAB感染为数不多的治疗选择之一。历史上，黏菌素耐药被认为仅由染色体突变引起，限制了其垂直传播。然而，黏菌素的广泛且往往不加选择的使用推动了质粒介导耐药机制的 emergence，使得耐药基因能够跨越不同细菌物种进行水平基因转移。2016年，首个可经质粒介导转移的 mobilized colistin resistance 基因（mcr-1）被发现，此后多个mcr家族及变异体已在全球六十多个国家的人类、动物和环境来源的细菌分离株中被描述。
尽管mcr基因在肠杆菌科（Enterobacteriaceae）成员中的传播已被广泛记录，但其在Acb复合群中的出现仍相对罕见，尤其是在动物来源的分离株中。鉴于越来越多的证据表明动物可能充当抗菌药物耐药决定因子的储存库和传播者，在动物来源的Acb复合群物种中检测到可移动的mcr相关黏菌素耐药决定因子具有重要的公共卫生意义。因此，本研究旨在使用多重PCR筛查从兽医和环境来源获得的Acb复合群分离株中的mcr基因。据研究人员所知，这是巴西里约热内卢州兽医来源的不动杆菌分离株中基于PCR检测mcr-7、mcr-8和mcr-9的首次报道。
二、研究设计与方法概述
研究人员从巴西里约热内卢州的一家私人兽医诊断实验室以及家禽养殖场环境土壤中，收集了2018年至2020年间来自犬、猫、马的尿路感染、足皮炎、耳炎和脓皮病病例以及家禽环境土壤样本的180株非发酵革兰阴性球杆菌（non-fermenting Gram-negative coccobacilli，NFGNC）进行评价。经表型初步鉴定后，35株被选为进一步鉴定和表征的不动杆菌属分离株，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行蛋白质组学鉴定，并采用针对recA基因（425 bp，不动杆菌属鉴定）、gyrB基因（294 bp，区分鲍曼不动杆菌与医院不动杆菌）、鲍曼不动杆菌特异性内转录间隔区（ITS，208 bp）和皮特不动杆菌特异性ITS区（150 bp）的多重PCR进行基因型鉴定。随后，对23株成功复苏的Acb复合群分离株，分别按照Rebelo等人和Borowiak等人的方案，通过多重PCR筛查mcr-1至mcr-5以及mcr-6至mcr-9基因。所有PCR反应均设置阳性和阴性对照，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后与预期片段大小比对确认。
三、研究结果
3.1 物种鉴定与两种鉴定方法的一致性
在35株不动杆菌属分离株中，MALDI-TOF MS鉴定结果为：14/35（40.00%）为鲍曼不动杆菌，11/35（31.43%）为皮特不动杆菌，4/35（11.43%）为医院不动杆菌，3/35（8.57%）为非Acb复合群物种（包括2株ursing不动杆菌和1株venetianus不动杆菌），1/35（2.86%）仅鉴定至属水平，2/35（5.71%）无法通过MALDI-TOF MS鉴定。多重PCR分子鉴定则将14/35（40.00%）归类为皮特不动杆菌，13/35（37.14%）为鲍曼不动杆菌，6/35（17.14%）为医院不动杆菌，2/35（5.71%）为不动杆菌属。两种方法对大多数分离株的鉴定结果一致，但对若干分离株存在差异。Cohen's kappa系数分析显示两种方法具有良好的一致性（κ = 0.729；95% CI: 0.509–0.949；p = 8.29 × 10?11），总体百分比一致性为80.0%（28/35）。
3.2 mcr基因筛查结果
在35株不动杆菌属分离株中，33株被归属于Acb复合群，其中12株在储存或处理过程中丢失无法复苏，其余23株成功复苏并进行了mcr基因筛查。其中5株（21.7%）PCR筛查阳性，产生与至少一个mcr靶标一致的扩增子：2株（8.7%）对mcr-7呈PCR阳性，1株（4.3%）对mcr-8呈阳性，2株（8.7%）对mcr-9呈阳性。值得注意的是，所有mcr阳性分离株均来自犬的尿液样本，除1株环境分离株来自土壤外，表明在动物相关和环境分离株中均检测到了mcr相关耐药决定因子。所有mcr阳性分离株均属于临床相关的Acb复合群物种。
四、讨论与结论
研究人员指出，本研究所采用的多重PCR鉴定方法存在固有局限性，仅能区分Acb复合群内的三个物种，限制了分类学分辨率。MALDI-TOF MS虽能提供可靠的物种水平鉴定，但通常需要置信分数高于2.3，而本研究中所有分离株的分数虽高于2.0，但均未超过2.3阈值，这可能导致了两种方法之间的差异。尽管如此，κ值为0.729表明两种方法具有良好的一致性，可作为常规鉴定的互补手段。
关于mcr基因的检出，研究人员强调，mcr-7首次在中国鸡源肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中发现，mcr-8在中国猪源和人源肺炎克雷伯菌中发现，mcr-9在美国人源多重耐药肠炎沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）中发现，这些基因的广泛地理和分类分布凸显了其显著的传播潜力。虽然mcr基因在肠杆菌科中最为常见，但在不动杆菌属中的检出仍不常见，尤其是在兽医和环境分离株中。本研究中通过多重PCR检测到mcr-7、mcr-8和mcr-9值得关注，但鉴于样本量有限且地理范围受限，这些发现应被视为这些决定因子在所评估分离株中存在的证据，而非其流行率或广泛分布的指示。
研究人员特别强调了一个重要的基因型-表型差异考量：mcr基因的存在并不一定与黏菌素表型耐药相关，其表达和表型效应可能取决于调控元件和遗传背景。此外，多重PCR方法无法区分染色体和质粒定位，也无法确认每个mcr组内的具体变异体。由于未进行扩增子测序、表型黏菌素药敏试验和质粒表征，本研究的发现不能确立表型黏菌素耐药、质粒介导耐药或水平传播的可能性。
研究结论： 本研究提供了巴西里约热内卢州兽医和环境来源Acb复合群分离株中mcr-7、mcr-8和mcr-9相关扩增子存在的初步PCR证据，这是该地区首次报道。鉴于缺乏扩增子测序、表型黏菌素药敏试验和基因组表征，这些结果不应被解读为已确认的mcr基因携带、表型黏菌素耐药或水平传播的证据。然而，这些发现强化了将动物和环境来源的Acb复合群分离株纳入“One Health”框架下综合抗菌药物耐药监测的重要性。未来需要更大规模和地理多样化的样本收集、序列确认、黏菌素最低抑菌浓度（MIC）测定、全基因组测序和质粒表征，以阐明这些决定因子的流行病学分布、遗传背景和潜在可移动性。
