基于LC-MS技术对贵腐酒中二元羧酸单乙酯类稀有化合物的鉴定及其作为托卡伊贵腐酒真实性标记的潜力研究

《Molecules》：RETRACTED: Kim et al. Anthocyanins Derived from Vitis coignetiae Pulliat Contributes Anti-Cancer Effects by Suppressing NF-κB Pathways in Hep3B Human Hepatocellular Carcinoma Cells and In Vivo. Molecules 2020, 25, 5445

　　

摘要专业翻译 托卡伊（Tokaj）产区是欧洲最古老、最著名的葡萄酒产区之一，横跨匈牙利和斯洛伐克两个邻国，两国均以出产高品质的贵腐酒（botrytized wines）而闻名。遗憾的是，迄今尚无针对此类葡萄酒中含量最丰富的单乙酯类化合物（monoethyl esters）的分析鉴定研究。本文中，研究人员采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS），对产自托卡伊产区的斯洛伐克和匈牙利贵腐酒及斯洛伐克品种酒（varietal wines）中常见的脂肪族二元羧酸和酚酸类化合物的主要单乙酯进行了鉴定，同时亦将产自法国苏玳（Sauternes）产区的贵腐酒纳入本研究。在所鉴定的化合物中，发现了一些独特的酯类，即酒石酸（tartaric acid）与肉桂酸（cinnamic acid）衍生物的共轭物。该鉴定基于对相应母离子和子离子的检测。鉴于所分析的乙酯类化合物在葡萄酒中的鉴定报道极为罕见，研究人员对其碎裂途径（包括所鉴定异构体的碎裂途径）进行了详细讨论。贵腐酒中某些已鉴定的独特酯类相对含量相近，这为利用这些化合物作为此类葡萄酒的真实性标记（authenticity markers）提供了潜在可能。

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一、研究背景与意义

葡萄酒中天然存在的有机酸会与大量过量的乙醇发生酯化反应，生成相应的酯类化合物。酯化反应及其逆反应——酯水解，受pH、温度及葡萄酒中其他成分等多种参数影响。因此，在葡萄酒陈酿过程中，酸与酯之间会建立一种平衡状态，这对葡萄酒的品质（尤其是香气和风味）具有重要影响。以往研究多集中于采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析脂肪酸乙酯，然而葡萄酒中的主要有机酸实为二元羧酸，即酒石酸和苹果酸，琥珀酸和柠檬酸（三羧酸）虽也存在，但浓度通常低于酒石酸和苹果酸。针对酒石酸、苹果酸、琥珀酸和柠檬酸的乙酯类化合物的分析研究远少于脂肪酸乙酯的研究。此外，葡萄酒中还存在另一类有机酸——酒石酸与肉桂酸衍生物的共轭物（形式上为酯类），即咖啡酰酒石酸（caftaric acid，酒石酸与咖啡酸的共轭物）、香豆酰酒石酸（coutaric acid，酒石酸与香豆酸的共轭物）和阿魏酰酒石酸（fertaric acid，酒石酸与阿魏酸的共轭物）。这些酸同样会与乙醇发生酯化反应，但据研究人员所知，关于所形成酯类的研究报道极为罕见，仅曾在雷司令葡萄酒和白葡萄酒中有过鉴定记录。

贵腐酒属于特殊的高品质甜型葡萄酒类别，具有宜人的蜂蜜风味和独特的水果香气。使用受灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）感染的浆果酿酒会显著改变最终产品的感官和化学特征。欧洲仅有少数几个产区生产此类葡萄酒，如匈牙利和斯洛伐克的托卡伊产区、法国的苏玳产区以及奥地利的布尔根兰产区。鉴于托卡伊产区贵腐酒的高经济价值及市场上存在的掺假风险，建立可靠、快速的质量评估方法具有重要的现实意义。本研究旨在鉴定贵腐酒和品种酒中二元羧酸的主要单乙酯类化合物，探索其作为贵腐酒真实性标记的潜力。

二、研究内容与主要结论

研究人员采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS），对产自托卡伊产区的斯洛伐克贵腐酒（SK_A–E）、匈牙利贵腐酒（HU_A–D）、斯洛伐克品种酒（SK_F–K）以及法国苏玳产区的贵腐酒（FR_A–C）共14个样品进行了系统分析。除预期存在的有机酸外，研究人员在每份样品中均鉴定出相应的单乙酯类化合物，并基于质谱数据（即[M ? H]^?和/或[M + H]⁺离子的碎裂途径）鉴定出极为罕见的化合物。

研究共鉴定出六种稀有的单乙酯类化合物，包括三种脂肪族单乙酯和三种酚类单乙酯。在脂肪族酸方面，检测到苹果酸单乙酯（2e）、酒石酸单乙酯（3e）和柠檬酸单乙酯（4e），此外还检测到柠檬酸二乙酯（4ee），但其丰度约为单乙酯的十分之一。值得注意的是，琥珀酸单乙酯未被检测到，推测其已被完全酯化为琥珀酸二乙酯，后者无法在负离子模式下被检测。在酚类酸方面，鉴定出香豆酰酒石酸单乙酯（5e）、咖啡酰酒石酸单乙酯（6e）和阿魏酰酒石酸单乙酯（7e），这些酯类极为罕见，此前仅有三篇关于其在葡萄酒中检测的报道，且均不涉及托卡伊葡萄酒。此外，在所有分析样品中还鉴定出另外两种化合物——咖啡酸乙酯和抗坏血酸，其中抗坏血酸的高含量很可能源于其在酿酒过程中作为二氧化硫的补充/替代抗氧化防腐剂被添加。

研究人员通过正离子模式下的LC-QTOF-MS/MS分析进一步确认了所分析稀有酯类的结构，获得了[M + H]⁺离子的精确质荷比以确认其元素组成，并获得了子离子谱以确定碎裂途径。研究发现，柠檬酸单乙酯（4e）两种异构体的子离子谱在子离子相对丰度上存在显著差异：第一种（含量较少、先洗脱）异构体的碎裂途径涉及连续丢失小分子（H₂O、HCOOH、C₂H₄、C₂H₅OH），较为复杂；而第二种（含量较多、后洗脱）异构体的碎裂途径主要为丢失HCOOH（m/z 175），随后丢失H₂O（m/z 157）。研究人员认为，这种碎裂途径有利于中心碳原子上连有游离羧基的异构体，因为丢失HCOOH分子产生的m/z 175子离子可通过共振稳定，随后因分子内氢键作用丢失H₂O。

在比较分析方面，研究人员对[M ? H]^?离子的色谱峰面积进行了对比。结果表明，匈牙利贵腐酒（HU_A–D）和法国贵腐酒（FR_A–C）的脂肪族酯类相对含量最为相似，尽管所分析葡萄酒的年份不同。匈牙利贵腐酒中酒石酸单乙酯（3e）的相对含量非常接近（19–22%），法国贵腐酒中各脂肪族酯类的相对含量也较为相似（样品间差异不超过3%）。斯洛伐克贵腐酒（SK_A–E）和托卡伊产区的品种酒（SK_F–K）中2e–5e的相对含量在样品间存在差异，且与匈牙利和法国贵腐酒的值不相似。在酚类酯方面，斯洛伐克贵腐酒（SK_A–E）的值最为相似，其中咖啡酰酒石酸单乙酯（6e）的相对含量在61–69%范围内；匈牙利贵腐酒（HU_A–D）中阿魏酰酒石酸单乙酯（7e）的相对含量非常接近（6–8%）。法国贵腐酒和托卡伊产区品种酒中5e–7e的相对含量在样品间存在差异，且与斯洛伐克和匈牙利贵腐酒的值不相似。

三、主要技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：液相色谱-质谱联用技术（LC-MS），使用Waters Arc HPLC泵和Waters SQD单四极杆质谱仪（配备电喷雾电离源），在负离子模式下对葡萄酒样品进行分析，采用反相C18色谱柱和乙腈-水线性梯度洗脱，锥孔电压分别设置为30 V和50 V；液相色谱-四极杆飞行时间质谱/质谱联用技术（LC-QTOF-MS/MS），使用UltiMate 3000 UHPLC系统和Impact HD质谱仪，在正离子模式下以8 eV的低碰撞能量获取[M + H]⁺离子的精确质荷比和子离子谱。葡萄酒样品经0.45 μm针式过滤器过滤后直接进样分析，无需其他样品前处理。样品来源涵盖斯洛伐克托卡伊产区贵腐酒（SK_A–E）和品种酒（SK_F–K）、匈牙利托卡伊产区贵腐酒（HU_A–D）以及法国苏玳产区贵腐酒（FR_A–C），所选葡萄酒均为陈年葡萄酒，选择依据为市场可获得性。

四、研究结果分述

2.1 LC-MS鉴定有机酸：研究人员在分析单乙酯的同时，也检测到了预期的脂肪族二元羧酸（琥珀酸1、苹果酸2、酒石酸3、柠檬酸4）和酚酸（香豆酰酒石酸5、咖啡酰酒石酸6、阿魏酰酒石酸7）。由于化合物2–4为亲水性化合物，在反相液相色谱中因与固定相相互作用弱而快速洗脱，出现拖尾峰；柠檬酸（4）因三羧酸性质可存在多种解离/未解离形式而出现峰分裂。酚酸5–7的ESI质谱图与已发表数据吻合良好。

2.2 LC-MS鉴定脂肪族酸的单乙酯：检测到苹果酸单乙酯（2e）、酒石酸单乙酯（3e）和柠檬酸单乙酯（4e），以及丰度约为4e十分之一的柠檬酸二乙酯（4ee）。琥珀酸单乙酯未被检测到，推测已完全酯化为无法在负离子模式下检测的琥珀酸二乙酯。酒石酸单乙酯（3e）以两种非对映异构体形式存在且丰度相当，二者的ESI质谱图几乎相同，均以丢失H₂O（m/z 159）为主。苹果酸单乙酯（2e）的峰形表明仅存在一种可能的异构体，基于m/z 71和73的子离子可确定乙基取代位点。柠檬酸单乙酯（4e）存在两种异构体且其中一种占主导，但基于[M ? H]^?离子的碎裂无法确定哪种异构体占主导。

2.3 LC-MS鉴定酚酸的单乙酯：鉴定出香豆酰酒石酸单乙酯（5e）、咖啡酰酒石酸单乙酯（6e）和阿魏酰酒石酸单乙酯（7e），这些酯类极为罕见，此前仅有少量检测报道。两种酯均发生酯键断裂，主要子离子为m/z 177，形式上对应于去质子化的酒石酸单乙酯。

2.4 LC-MS鉴定其他化合物：在所有分析样品中均鉴定出咖啡酸乙酯和抗坏血酸。与所有其他酯类不同，咖啡酸乙酯对应的酸（咖啡酸）未被检测到，此类情况在葡萄酒分析中已有先例。抗坏血酸的高相对含量很可能源于其作为二氧化硫的补充/替代抗氧化防腐剂被添加到葡萄酒中。

2.5 正离子模式下的LC-QTOF-MS/MS分析：通过正离子模式下的MS/MS分析，获得了[M + H]⁺离子的精确质荷比以确认元素组成。脂肪族酯2e的碎裂涉及丢失小分子（H₂O和HCOOH），酚类酯6e的碎裂仅形成m/z 163的丰富子离子。柠檬酸单乙酯（4e）两种异构体的子离子谱差异显著，据此可区分异构体：第一种（含量较少）的碎裂途径复杂，涉及连续丢失小分子；第二种（含量较多）的碎裂途径主要为丢失HCOOH（m/z 175）后丢失H₂O（m/z 157），该途径有利于中心碳原子上连有游离羧基的异构体。

2.6 葡萄酒样品中分析物丰度的比较分析：通过比较[M ? H]^?离子的色谱峰面积，发现匈牙利贵腐酒和法国贵腐酒的脂肪族酯类相对含量最为相似；匈牙利贵腐酒中3e的相对含量非常接近（19–22%），法国贵腐酒中各脂肪族酯类的相对含量差异不超过3%。斯洛伐克贵腐酒和品种酒的值与匈牙利和法国贵腐酒不相似。在酚类酯方面，斯洛伐克贵腐酒的值最为相似（6e为61–69%），匈牙利贵腐酒中7e的相对含量非常接近（6–8%）。这些相似性可能归因于贵腐化过程以及特定的陈酿和储存条件。

五、结论

在所有经LC-MS分析的葡萄酒样品中，共检测到六种稀有的单乙酯类化合物：三种脂肪族和三种酚类。其结构（包括苹果酸单乙酯和柠檬酸单乙酯的异构体区分）基于[M ? H]^?和[M + H]⁺离子的特征碎裂途径得以推断。研究发现，某些已鉴定的独特化合物在贵腐酒中的相对丰度非常相似，而斯洛伐克品种酒则不然。例如，斯洛伐克贵腐酒中咖啡酰酒石酸单乙酯（6e）的相对含量在61–69%范围内，匈牙利贵腐酒中阿魏酰酒石酸单乙酯（7e）的相对含量非常接近（6–8%）。观察到的相似性可能归因于贵腐化过程以及特定的陈酿和储存条件。这些结果提供了利用这些独特化合物作为贵腐酒真实性标记的潜力，尽管研究人员认识到这一结论需要使用同位素标记的标准品加以确认。