胚胎胶质细胞作为章鱼脑发育的早期组织中心——nr4a+胶质群体协调神经元迁移、轴突导向与脑图式形成

《Current Biology》：Dynamic roles of embryonic glial cells in octopus brain development

　　

鞘形头足类（coleoid cephalopods），如章鱼、鱿鱼和乌贼，已演化出显著大的神经系统，其神经元数量与小哺乳动物相当。尽管如此，对于这些神经系统如何发育、哪些遗传程序驱动其神经细胞的形成与多样化、以及哪些因素促进演化性脑扩张，仍知之甚少。本研究结合单细胞多组学（single-cell multi-omics）与空间表达分析（spatial expression analysis），揭示普通章鱼（Octopus vulgaris）神经系统发育与演化所涉及的细胞类型及调控机制。研究人员发现一个早期胚胎胶质细胞群体，其不同于神经源性祖细胞（neurogenic progenitors），并由孤儿核受体4a（orphan nuclear receptor 4a，nr4a）、远端缺失同源盒（distal-less homeobox，dlx）和prospero同源盒（prospero homeobox，pros）调控子（regulons）所定义。这些细胞在胚胎发生过程中的空间分布和动态转录谱提示，它们可能在表达神经元标志物或分化为成熟胶质细胞之前协调细胞迁移、轴突导向和脑图式形成。对两种头足类、一种腹足类和Drosophila的胚胎胶质转录特征进行比较发现，nr4a、dlx和pros在软体动物中共享表达，而Drosophila胚胎胶质表达pros、dlx、repo、ttk和gcm，但不表达nr4a。值得注意的是，头足类胚胎胶质的整体基因表达谱已与Pomacea canaliculata（golden apple snail）分化，后者的胶质不表达导向或图式形成基因。总之，这些发现鉴定出软体动物中一种保守的胚胎胶质细胞类型，该细胞类型可能在鞘形头足类中获得新功能，以组织其扩张脑中的神经元迁移和线路连接。

论文解读：本研究围绕头足类大脑如何发育与演化展开。鞘形头足类具有与小型哺乳动物相当的神经元数量，但其神经系统发育的细胞类型、遗传程序和演化扩张机制仍不清楚。脊椎动物脑扩张常与放射状胶质细胞（radial glial cells，RGCs）等祖细胞扩增相关，但无脊椎动物独立演化出大神经系统，是否存在类似胶质组织者尚不明确。成年头足类胶质已有组织学研究，普通章鱼幼体脑中也鉴定出转录上不同的胶质细胞类型，但这些胶质细胞何时出现、是否参与脑发育仍未知。普通章鱼脑由脑索融合形成不同脑叶，胚胎期大多数脑神经元在侧唇（lateral lip，LL）神经发生区产生，而脑本身大多为有丝分裂后；视索（optic cord，OC）在stage VII.2已存在，却缺乏已知神经元标志物。因此，研究人员推测早期脑索中的非神经元细胞可能对脑发育具有重要作用，并采用单细胞多组学与空间表达分析来鉴定脑索生长相关细胞类型及早期活跃的转录因子（transcription factor，TF）调控程序。
主要关键技术方法：普通章鱼（Octopus vulgaris）胚胎来自西班牙Tenerife的IEO（Instituto Espa?ol de Oceanografía），金色苹果螺（Pomacea canaliculata）胚胎来自美国University of California, Davis的群体，夏威夷短尾鱿（Euprymna scolopes）第25期胚胎由奥地利维也纳Haus des Meeres的Anton Weissenbacher提供，Drosophila melanogaster使用公开snRNA-seq数据。研究人员采用10X Multiome与GEM-X进行单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）和单核ATAC测序（single-nucleus ATAC sequencing，snATAC-seq），用SCENIC+推断调控子，非负矩阵分解（non-negative matrix factorization，NMF）识别表达程序，Monocle进行伪时间（pseudotime）分析，自组装流形映射（self-assembling manifold mapping，SAMap）进行跨物种比较，原位杂交链式反应（in situ hybridization chain reaction，HCR）进行空间验证，并用Orthofinder推断同源基因。
研究结果：
早期普通章鱼OC缺乏神经元身份。HCR显示ascl1/2主要标记LL与视网膜，neuroD标记靠近脑索及LL来源迁移神经元，elav仅在stage IX的OC微弱出现；stage VII.2的脑索区域不表达ascl1/2、neuroD或elav，提示早期脑索最初由不表达已知神经标志物的细胞构成。
单细胞图谱揭示胚胎内神经发育。研究人员整合stage IX、XII.2和XV.2全胚胎snRNA-seq数据，获得64,389个高质量细胞和7个主要细胞群：内皮、上皮、胚胎胶质、中胚层、分化神经元、神经祖细胞和视网膜。视网膜、神经祖细胞和分化神经元占52%，显示发育的神经元偏倚；神经祖细胞富集于stage IX，分化神经元富集于XII.2和XV.2，符合祖细胞向神经元分化。神经祖细胞表达ascl1/2及slug，分化神经元表达neuroD、elav、onecut、Insm1和tbx2/3，HCR验证tbx2/3标记早期迁移神经元。
胚胎胶质细胞先于神经元占据OC。研究人员鉴定apolpp⁺、pnt⁺的GLIA群，表达gif及高水平的nr4a和dlx。HCR显示nr4a和dlx在stage VII.2的OC原基高表达，stage IX位于OC边界及PTZ，pnt信号较弱并与nr4a部分匹配。结论是胚胎胶质细胞构成初始OC，随后新生神经元才侵入。
胚胎胶质细胞在发育中发生功能成熟。对胶质亚群行NMF得到Ov1–Ov9表达程序，并依据同源基因已知功能预测生物学功能（predicted biological functions，PBFs）。早期Ov1富集组蛋白和DNA合成基因，提示增殖性胶质祖细胞；中期Ov2富集slit、rgm、ptc、vgfr（轴突导向），Ov3富集shh、hox3、nkx61、nk7.1（shh图式形成），Ov4富集wnt；Ov5富集insm、neuroD、elav等神经元转录因子；后期Ov6富集nmdar及six1/2、six5/4，Ov7富集cad23和protocadherin（黏附/线路连接），Ov8富集grik同源基因、5ht5a、acha（神经递质响应），Ov9富集apolpp、gif、netrin（成熟胶质）。伪时间分析显示stage IX细胞伪时间较低，XV.2细胞随伪时间增加；Ov5形成独立亚轨迹，称为“神经元胶质”。结论是胚胎胶质从增殖祖细胞，经信号与导向角色，走向成熟特化胶质。
空间分布确认胚胎胶质细胞的多样角色。HCR显示stage IX的nr4a与pcna在OC外侧共表达，nr4a与insm在OC内侧共表达；stage XII.2在OL皮层及OL-SEM边界可见nr4a⁺/pcna⁺细胞和nr4a⁺/insm⁺神经元胶质，少数pcna⁺/nr4a⁺/insm⁺细胞可能为增殖性神经元胶质；stage XV.2的nr4a在LL神经发生区与elav、ascl1/2重叠，PTZ新生神经元保留nr4a。nr4a与pnt的HCR显示，XII.2的nr4a⁺细胞位于PLX附近、视网膜邻区和OC-PVC边界；XV.2的OL中nr4a限于PLX，pnt与nr4a在PLX衬里细胞中共表达。结论是不同胶质亚群的角色与其空间分布匹配，OC胶质表达导向线索和生长因子，可能引导LL来源神经元进入OC并吸引视网膜光感受器轴突进入OL；早期OL可能存在神经发生事件及向神经元分化的证据。
染色质可及性揭示不同的神经元与胶质调控程序。SCENIC+分析stage IX和XII.2多组学数据，topic建模重现神经元分化轨迹；ascl1/2和onecut分别为神经祖细胞和分化神经元的特异调控子，slug、e2f、tfdp、myb在神经祖细胞活跃；insm1/2 RNA在两类细胞中可见，但其调控子在分化神经元特异活跃；gli调控子作为潜在抑制因子在分化神经元活跃。snATAC-seq显示从神经祖细胞到分化神经元有两条分化路径，分别由nkx24/21和nkx61/62/63调控子标记；HCR显示nkx24/21位于AVLL和CC原基，后见于AVLL、ADLL、PTZ及连接ALL到口部的SEM组织，提示其调控SEM神经元分化；nkx61/62/63位于眼基板邻近LL内侧，后见于OL、PVL和PL，提示其调控OL与SUB神经元分化。结论是研究人员重现了神经元分化路径，并鉴定出前后脑图式形成中的保守调控因子。
不同转录因子调控胚胎胶质细胞的命运与功能。GLIA的snATAC-seq分析得到三个亚群：祖胶质（PG）、主胶质（MG）和神经元胶质（NG）；nr4a、dlx和pros调控子在GLIA中差异活跃。PG高表达tfdp及rbl1/2、rxr、nr2c1/2调控子；MG特异活跃nr4a和dlx，pros无亚型特异性，并有suh和klf12/3，suh为Notch信号直接介导者，jag在相关NMF程序中富集；NG高表达runx和setbp。NMF程序与亚群连接显示，PG表达Ov1/Ov2，NG表达Ov3/Ov5，MG和NG表达Ov4及Ov6–Ov9；TF-基因连接显示Ov1–Ov3主要由tfdp、rxrA/B/G、nr2c1调控，runx调控Ov5，nr4a、klf12/3、dlx调控Ov6–Ov8，gif和apolpp受tfdp和klf1/2/3调控。结论是胚胎胶质由nr4a、dlx、pros核心调控复合体定义，亚型由不同阶段特异调控状态驱动，协调从增殖祖细胞向图式形成和神经元胶质的转变。
金色苹果螺胚胎胶质细胞转录上不同。对Pomacea canaliculata 6和9 dpf胚胎行snRNA-seq，获得22,261个高质量细胞和6个类似细胞群；EPI和N-PROG富集6 dpf，MES、ENDOT、GLIA和N-DIFF主要来自9 dpf。NMF得到Pc1–Pc9：Pc1富集溶酶体降解酶，Pc2富集nr4a、pros、dlx，Pc3富集neuroD、insm、elav等神经元基因，Pc4/Pc5富集谷氨酸受体和protocadherin，Pc6富集肌钙蛋白和肌球蛋白，Pc7–Pc9富集突触基因、小分子转运体和中间丝等成熟胶质功能。伪时间分析显示两个时间点贡献所有伪时间，NMF程序未按预期轨迹分布，提示胶质角色较稳定；与普通章鱼程序重叠很低，仅Pc3与Ov5中度重叠并共享scrt1/2、neuroD、insm、elav；早期增殖或轴突导向程序仅见于章鱼，溶酶体和收缩细胞骨架程序仅见于苹果螺。结论是苹果螺胚胎胶质共享nr4a、dlx、pros，但转录程序更接近经典稳态胶质功能，缺乏章鱼胚胎胶质的指导性导向和信号角色；组织者功能可能在鞘形头足类中作为新特性演化，以支持脑发育中的长距离神经元迁移。
跨物种比较揭示胶质创新。对Euprymna scolopes stage 25行snRNA-seq，鉴定出与普通章鱼相同的细胞群，神经元群表达ascl1/2、neuroD、elav，胚胎胶质表达nr4a、dlx、pros；胶质群比例在普通章鱼为5%，E. scolopes为2.8%，P. canaliculata为1.7%。SAMap整合四种snRNA-seq数据，头足类之间N-PROG、N-DIFF和GLIA对齐分数高（>0.8）；头足类与螺或蝇比较，N-DIFF较高（>0.73），N-PROG中等（0.55–0.74），GLIA较低（0.2–0.4），提示头足类胶质转录组已分化。果蝇胶质调控基因包括gcm、pros、repo、ttk、pnt；软体动物基因组未发现repo和ttk直系同源基因，gcm在头足类GLIA不表达、在P. canaliculata GLIA有限表达；nr4a和dlx同源基因在软体动物胶质高表达，而果蝇同源基因Hr38和dll几乎不表达；pnt和pros同源基因在所有物种胚胎胶质中表达，提示pros和pnt可能存在于祖先胚胎胶质细胞类型中，或为趋同演化。
讨论与结论：研究人员提出模型：胶质发生与神经发生最初是分离事件，早期胶质群体作为组织中心协调脑图式形成，后期群体支持神经发生或分化为成熟胶质。与脊椎动物RGC先产生神经元再转向胶质发生不同，本研究中胚胎胶质先占据OC，LL来源神经元随后侵入，提示替代性发育序列。果蝇中初级胶质来自部分神经元谱系，次级胶质由II型神经母细胞先产神经元后产胶质；本研究发现后期小胶质亚群可能生成或分化为神经元，类似果蝇神经胶质母细胞，但需谱系追踪证明。早期富胶质脑索并非被动迁移底物，而可能提供导向线索；果蝇中线胶质表达slit和netrin，脊椎动物底板胶质表达sonic hedgehog和netrin，本研究中早期胶质程序富集slit和rgm等排斥性导向分子。XII.2时OL胚胎胶质围绕形成中的PLX组织，视网膜光感受器轴突进入OL并与后生神经元突触连接，此过程与哺乳动物板下神经元在丘脑皮层回路形成中的作用相似，板下神经元也表达nr4a。P. canaliculata未发现这种瞬时组织中心，其胶质程序主要支持突触稳态，仅有一个前神经程序；SAMap显示其与头足类胶质相似性低。nr4a、dlx、pros在所有软体动物中保留，提示决定细胞类型的转录因子保留而细胞类型功能演化；驱动新导向程序的转录因子不同于经典胶质转录因子。头足类保留泛软体动物胶质调控程序，但获得新模块以组织广泛神经元迁移和线路连接；pros和pnt构成软体动物与果蝇共享的核心胶质调控程序，但仅凭少数基因和较大演化距离尚不能完全区分共同起源与趋同演化，需要更多原口和后口动物比较。研究结论翻译：总之，这些发现鉴定出软体动物中一种保守的胚胎胶质细胞类型，该细胞类型可能在鞘形头足类中获得新功能，以组织其扩张脑中的神经元迁移和线路连接。