基于比色染料赤藓红B的动态蛋白-配体结合事件预筛检测方法研究

《Sensors》：Formation-Dependent Cardinality Concealment of Target Swarms in Multifunction Radar

　　

比色技术及其相关染料，相较于荧光和发光类方法，在许多筛选应用中可提供更低成本和更易获取的替代方案。本研究旨在筛选适用于蛋白-配体结合推定检测（presumptive assay）的比色染料，特别关注那些构象动态性高、常难以用标准生物物理方法研究的蛋白。研究人员从23种市售比色染料中筛选出3种候选染料，它们在两种结构迥异的目标蛋白Med25 AcID和CBP KIX存在时表现出浓度依赖性的吸光度变化。针对蛋白-配体结合事件的后续研究将焦点缩小至赤藓红B（erythrosin B），它是Med25和CBP与现有小分子配体结合事件中最灵敏的报告染料。值得注意的是，Med25–降斑点酸（norstictic acid）和CBP–藤黄酸（garcinolic acid）复合物的结合数据所呈现的聚类模式，与正交测得的两类复合物的热稳定性数据一致。因此，诸如赤藓红B之类的比色染料，可作为高价值蛋白靶标（包括构象可塑性较高的蛋白）推定筛选检测中更易获取的工具。

论文解读

一、研究背景与问题

真核生物蛋白质组中超过50%的蛋白含有 intrinsically disordered regions（IDRs，内在无序区域），具有构象动态性特征。在转录调控、蛋白质折叠等细胞过程中，构象可动性是蛋白功能的内在要求，而这类蛋白在病理状态中的普遍存在也推动了对其研究和靶向的需求。例如，BRAFV600E驱动的黑色素瘤中，富含IDR且构象动态的ETV5-Med25复合物的失控形成是疾病侵袭性的关键因素，使其成为有吸引力的治疗靶点，但相关研究进展缓慢。ETV5和Med25等动态蛋白往往极难研究和靶向，因为许多常用的生物物理和生化检测方法是为具有稳定三维结构的蛋白开发的，对构象动态蛋白的适用性有限。因此，研究人员亟需寻找可获取且灵敏度合适的替代方案来检测构象动态蛋白的结合事件。

二、研究目的与设计思路

荧光染料在经典蛋白和动态蛋白的检测中是有价值的试剂。在差示扫描荧光法（differential scanning fluorimetry，DSF）中，环境敏感型荧光染料SYPRO orange在热诱导蛋白去折叠时信号强度发生变化，可快速测量蛋白在有无结合伴侣条件下的稳定性。研究人员注意到SYPRO orange及相关荧光染料与比色染料在结构上的相似性。比色染料在临床诊断、环境监测、食品安全、研究诊断和法医筛查等应用中已成为低成本、快速且灵敏的检测试剂。在许多情况下，与生物分子（包括蛋白质）的结合是比色染料应用的内在特性。研究人员假设，使用此类染料的比色检测可为构象动态蛋白与潜在结合伴侣的初步筛选提供更易获取的策略。

为验证这一假设，研究人员选择了两种代表动态蛋白挑战与机遇的蛋白基序作为靶标：Med25 AcID和CBP KIX。尽管结构不同，Med25 AcID和CBP KIX在转录起始过程中与无序转录因子基序结合，且常在疾病中失调。两种蛋白均表现出显著的构象可塑性，与转录因子和小分子以中等亲和力相互作用，这使得许多常见的蛋白结合相互作用的推定检测方法对这两种蛋白无效或难以适应。

三、主要技术方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：紫外-可见吸收光谱法（UV-Vis absorbance spectroscopy），用于测量染料与蛋白相互作用后的吸光度变化；主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），用于降低光谱数据维度并揭示不同条件下的聚类模式；多元方差分析（Multivariate Analysis of Variance，MANOVA），用于评估样本组间光谱特征的显著性差异；轮廓系数（silhouette score）用于评估聚类质量；差示扫描荧光法（DSF）作为正交验证方法，使用SYPRO orange染料测量蛋白-配体复合物的热稳定性变化。样本为重组表达的Med25 AcID和CBP KIX蛋白，均在E. coli中表达纯化。

四、研究结果

4.1 候选比色染料的筛选

研究人员首先测量了23种结构多样且市售可得的染料在递增浓度的CBP KIX和Med25 AcID存在下的吸收光谱。从中筛选出赤藓红B、溴百里酚蓝（bromothymol blue）和固绿FCF（fast green FCF）三种候选染料，它们表现出可重复的、蛋白浓度依赖的光谱变化，且对CBP KIX和Med25 AcID的响应具有区分性。赤藓红B在蛋白存在时产生5 nm的λ_max红移（bathochromic shift）伴随峰强度小幅降低（hypochromic shift），这与先前赤藓红B-蛋白结合研究的观察一致。溴百里酚蓝在任一蛋白存在时整个光谱出现减色位移，与Med25 AcID共存时还有小幅红移。固绿FCF在吸收峰边缘显示微小位移。对照染料甲基橙（methyl orange）对两种蛋白几乎无区分性。通过PCA分析，赤藓红B对CBP KIX和Med25 AcID各条件产生离散的聚类，因此被选为后续研究的候选染料。

4.2 蛋白浓度依赖的赤藓红B光谱响应

研究人员在蛋白浓度最高至32 μM、赤藓红B浓度为10 μM的条件下，以四重复测试了赤藓红B的光谱变化。整个浓度范围内未观察到蛋白沉淀或聚集。PCA分析显示，CBP KIX和Med25 AcID均存在蛋白浓度依赖的光谱响应。对于CBP KIX，赤藓红B在每个浓度产生不同的聚类，尽管轮廓系数（0.231）表明PCA空间中单个观测的分离不完全，但MANOVA结果表明各样本组具有不同且显著的多元光谱特征。Med25 AcID在所有浓度下的光谱响应均与仅含染料的条件不同，但8 μM和32 μM的数据重叠，表明在较高蛋白浓度下信号趋于饱和，这也反映在较低的轮廓系数上。

4.3 赤藓红B比色检测对配体结合事件的识别

研究人员将赤藓红B比色检测应用于推定结合检测格式，使用两种已充分表征的小分子配体进行基准验证：藤黄酸（garcinolic acid，GA）以K_D为1 μM与CBP KIX结合，通过混合变构和正构机制抑制KIX-转录因子相互作用；降斑点酸（norstictic acid，NA）是Med25 AcID的共价配体，IC₅₀为4 μM，选择性地与动态的富赖氨酸环形成Schiff碱。在CBP KIX•GA实验中，轮廓系数为0.818，MANOVA显示样本身份对PCA得分有高度显著影响，表明添加藤黄酸后组内相似性高、组间分离强。在Med25 AcID•NA实验中，观察到剂量依赖性变化，聚类间分离度相对较低（轮廓系数0.316），但MANOVA再次确认样本身份对多元PCA得分有统计学显著影响。在两种蛋白实验中，在单个当量配体时即观察到明显变化，且呈现清晰的剂量依赖性。

4.4 与差示扫描荧光法的平行比较

研究人员在平行条件下对CBP KIX•藤黄酸和Med25 AcID•降斑点酸组合进行了DSF检测。结果显示，降斑点酸和藤黄酸以剂量依赖方式改变各自靶蛋白的热稳定性，通过SYPRO orange荧光变化可检测到。综合来看，赤藓红B比色检测提供的结果与更成熟的DSF检测结果类似，验证了比色方法的可靠性。

五、讨论与结论

研究数据表明，赤藓红B吸光度在不同蛋白（CBP KIX、Med25 AcID）存在下、不同蛋白浓度下以及Med25 AcID•降斑点酸和CBP KIX•藤黄酸复合物形成时的变化，源于与蛋白的相互作用。赤藓红B以其“混杂蛋白结合能力”著称，适合作为比色蛋白结合检测中的广谱报告分子。与常用的DSF报告染料SYPRO orange类似，赤藓红B结合疏水蛋白区域并对环境极性敏感。

赤藓红B比色检测是一种推定检测，适合提供值得进一步研究的蛋白-配体结合相互作用的初始信号。在成本方面，赤藓红B约150美元/100 g，而SYPRO orange约300美元/500 mL。紫外检测所需仪器通常比需要变温控制的荧光检测仪器成本更低，例如便携式紫外-可见96孔板读取器约5000美元，而DSF常用的台式实时定量PCR仪器价格在10,000至30,000美元之间。因此，比色染料用于蛋白表征和筛选的方法为DSF等技术提供了更易获取的替代方案，降低了进入稳健分析工作流程的门槛。

研究结论指出，基于吸收光谱数据，市售比色染料可被评估为Med25 AcID和CBP KIX蛋白配体结合事件的报告分子。在识别的三种染料中，赤藓红B对蛋白靶标表现出多功能性，并能检测配体诱导的稳定化。此外，该比色染料比更成熟的DSF技术提供了更低成本的分析工作流程切入点。该方法的局限性在于目前仅在两种动态蛋白上得到验证，其适用于更广泛蛋白类别的程度尚待确定；此外，该检测格式针对高纯度分离蛋白设计，目前形式不太可能适用于复杂裂解液或类似的异质环境。未来，更广泛的筛选活动以识别具有更稳健光谱响应的比色染料，将扩展该方法超越推定应用范围的实用性。