p65 C197/C206自棕榈酰化增强NF-κB转录活性并可被Licochalcone D药理学阻断

《Cell Reports》：Pharmacological blockade of p65 palmitoylation modulates NF-κB transcriptional activity

　　

核因子κB（NF-κB）调控炎症与免疫，并在自身免疫病、炎症性疾病和癌症中频繁失调。细胞因子和病原体可激活NF-κB转录因子，营养素和代谢物（包括脂肪酸）也调节其激活，但其潜在机制仍不清楚。研究人员报道，NF-κB转录复合物的主要组分RelA（p65）在半胱氨酸197和206位点发生自棕榈酰化。p65棕榈酰化增强其核定位和p65-p50复合物形成，从而提高NF-κB转录活性。研究人员进一步发现，小分子抗炎化合物licochalcone D直接抑制RelA/p65自棕榈酰化，提示其可能通过额外机制发挥作用。这些结果表明，脂肪酸代谢可通过p65棕榈酰化直接调节NF-κB活性，并提示靶向p65自棕榈酰化可能成为NF-κB信号失调疾病的治疗策略。

研究背景：NF-κB（nuclear factor kappa B，核因子κB）是炎症与免疫反应的核心转录因子，由RelA（p65）、RelB、c-Rel、NF-κB1（p50）和NF-κB2（p52）等成员形成二聚体。静息状态下，NF-κB与IκB（inhibitor of NF-κB，NF-κB抑制蛋白）结合而滞留于胞质；TNFα或LPS等刺激后，IκBα被IKK（IκB kinase，IκB激酶）磷酸化并发生蛋白酶体降解，NF-κB复合物入核发挥转录活性。p65是经典NF-κB通路的主要组分，与p50形成复合物；p65敲除小鼠因TNFα介导的胎肝细胞凋亡而胚胎致死。p65的乙酰化、泛素化、磷酸化和氧化等翻译后修饰可调控其功能，这些修饰失调与自身免疫病和癌症相关。棕榈酸作为主要脂肪酸，可通过内质网应激相关IRE1α-IKK-TRAF2复合物形成以及PERK-eIF2α抑制IκBα翻译等机制增强NF-κB激活，但精确机制仍不清楚。棕榈酸可转化为棕榈酰辅酶A，作为蛋白质S-棕榈酰化（S-palmitoylation，半胱氨酸残基连接棕榈酰基的翻译后修饰）的底物；zDHHC（zinc finger DHHC-type palmitoyltransferase，锌指DHHC型棕榈酰转移酶）催化多数膜蛋白棕榈酰化，但TEAD、BET3和RFX3等可发生酶非依赖的自棕榈酰化。cGAS、STING、MYD88、NLRP3和GSDMD等蛋白的S-棕榈酰化可调控炎症和免疫信号，但脂肪酸和S-棕榈酰化是否直接调控NF-κB组分尚不清楚。因此，研究人员开展本研究，发现p65在C197和C206位点自棕榈酰化，促进其核转位、NF-κB复合物形成和转录活性；高脂饮食（high-fat diet，HFD）小鼠组织中p65棕榈酰化升高并与细胞因子表达相关；licochalcone D可抑制p65自棕榈酰化并抑制NF-κB激活。该研究提示脂质代谢与炎症之间存在直接机制联系，并为NF-κB信号失调疾病提供了靶向p65自棕榈酰化的潜在策略。

关键技术方法：研究人员使用炔基棕榈酸（alkyne palmitic acid，Alk14）标记、点击化学、链霉亲和素富集、免疫印迹和液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）检测p65棕榈酰化及位点；采用酰基生物素交换（acyl biotin exchange，ABE）和脉冲追踪实验；用重组全长p65及RHD（Rel homology domain，Rel同源结构域）蛋白进行体外自棕榈酰化实验；在p65敲除（knockout，KO）HEK293A细胞中重建野生型（wild type，WT）和2CS突变体，开展免疫荧光、亚细胞分级、免疫沉淀-质谱（immunoprecipitation-mass spectrometry，IP-MS）、染色质免疫沉淀-qPCR（chromatin immunoprecipitation-qPCR，ChIP-qPCR）、荧光素酶报告、RT-qPCR和RNA-seq；高脂饮食组织样本来自The Jackson Laboratory的C57BL/6J DIO（diet-induced obese，饮食诱导肥胖）小鼠，每组n=5，6周龄开始正常脂或高脂饮食14天至8周龄取材。

研究结果：
（1）RelA/p65 is palmitoylated at cysteine 197 and 206：通过Alk14标记、点击化学、链霉亲和素富集及质谱和免疫印迹，研究在HEK293A和PMA诱导THP1细胞中检测到p65棕榈酰化；TNFα或LPS处理未显著改变其总体棕榈酰化信号；羟基胺处理可裂解硫酯键并降低p65棕榈酰化信号；亚细胞分级显示胞质和核内均可检测到棕榈酰化p65；脉冲追踪显示p65棕榈酰化较稳定，半衰期近20 h；单一半胱氨酸突变未显著改变信号，而C197/C206双突变（2CS）显著降低棕榈酰化，ABE实验进一步验证C197和C206为关键位点。

（2）RelA/p65 is autopalmitoylated at cysteine 197 and 206：化学探针富集提示p65具有脂质结合位点和反应性半胱氨酸；过表达部分zDHHC可轻微增加p65棕榈酰化，但敲除或敲低这些zDHHC未显著改变p65棕榈酰化；triacsin C降低棕榈酰辅酶A水平后，p65棕榈酰化呈剂量依赖性下降；重组全长p65与Alk14-CoA呈剂量依赖性反应，表观K_m约589.7 nM，且羟基胺处理降低信号；RHD结构域WT可与Alk14-CoA反应，2CS显著降低；LC-MS/MS鉴定到C206的IAA修饰肽。结果表明p65可发生酶非依赖的自棕榈酰化，C197和C206为主要位点。

（3）Palmitoylation of p65 promotes its protein stability：在p65 KO HEK293A细胞中，WT p65蛋白水平高于2CS，MG132可部分逆转该差异；2CS的mRNA水平低于WT且降解更快；2CS泛素化信号高于WT；棕榈酸处理降低内源性p65泛素化；结构模拟未显示2CS导致整体错误折叠。结果表明p65棕榈酰化增强其蛋白稳定性。

（4）Palmitoylation regulates p65 nuclear localization and NF-κB complex formation：免疫荧光和亚细胞分级显示TNFα刺激后WT p65核转位强于2CS；AlphaFold3预测C197位于p65-p50结合界面附近；IP-MS显示WT p65较2CS结合更多p50、RelB、IκBα和IκBε等；归一化后2CS结合RelB和p50分别约为WT的16%和52%；棕榈酸处理增强p65-p50和p65-RelB相互作用；结构分析显示棕榈酰化不遮挡p65-p50界面，而增加链间接触对和埋藏表面积；ChIP-qPCR显示WT p65较2CS更强结合TNF启动子。结果表明棕榈酰化促进p65核转位和NF-κB复合物形成。

（5）Palmitoylation of p65 enhances its transcriptional activity：荧光素酶报告显示p65 KO细胞中WT可恢复NF-κB报告活性，而2CS显著降低；棕榈酸增强NF-κB报告活性，triacsin C抑制该活性，且WT对triacsin C更敏感；RT-qPCR显示WT重建细胞的TNF mRNA水平高于2CS；棕榈酸联合重组TNFα仅在上调WT细胞的TNF mRNA；p65 Ser536磷酸化在WT和2CS间无显著差异；RNA-seq显示WT上调1170个基因，2CS仅上调67个基因；GSEA（gene set enrichment analysis，基因集富集分析）显示WT样本富集NF-κB和Toll样受体通路，2CS样本富集组蛋白乙酰转移酶相关通路。结果表明p65棕榈酰化增强NF-κB转录输出。

（6）RelA/p65 palmitoylation correlates with cytokine expression in the spleen of mice fed with a high-fat diet：在PMA诱导THP1细胞中，BSA偶联棕榈酸较其他脂肪酸更显著诱导TNF和IL1A表达，并使分泌TNFα由31.12 pg/mL升至264.88 pg/mL；HFD小鼠肺、骨骼肌和脾中p65棕榈酰化升高；HFD小鼠脾TNF和IL1A升高，并与p65棕榈酰化水平呈正相关（Spearman分析p=0.0065和p=0.0313）。结果提示p65棕榈酰化与高脂饮食小鼠炎症表型相关。

（7）Small-molecule inhibitor of p65 autopalmitoylation suppresses NF-κB activation：通过体外p65自棕榈酰化实验筛选NF-κB通路抑制剂和内部棕榈酰化抑制剂库，发现licochalcone D剂量依赖性抑制p65自棕榈酰化，IC₅₀为4.76 μM，并与棕榈酰-CoA呈竞争关系；细胞实验中licochalcone D降低内源性p65棕榈酰化；荧光素酶实验显示其抑制TNFα和棕榈酸诱导的NF-κB激活，TNFα刺激下IC₅₀为3.38 μM；该抑制依赖p65棕榈酰化，仅在WT p65表达细胞中观察到，而在2CS表达细胞中未观察到；licochalcone D下调TNF和CCL1表达，且该效应依赖p65棕榈酰化；AlphaFold3预测棕榈酰基和licochalcone D位于p65同一表面界面区域。结果表明licochalcone D是p65自棕榈酰化抑制剂，可抑制NF-κB激活。

讨论部分总结：研究人员将p65棕榈酰化确定为棕榈酸诱导NF-κB激活的附加调控层；C197和C206位于介导二聚化和DNA结合的RHD内，2CS突变降低p65转录活性、核转位及与p50和RelB的相互作用。该机制可与既往报道的高剂量棕榈酸经内质网应激促进IκBα降解和NF-κB核转位机制协同。尽管部分zDHHC过表达可轻微增加p65棕榈酰化，但功能缺失实验未支持其直接调控，提示p65主要发生酶非依赖自棕榈酰化；C38未检测到棕榈酰化，其烷基化不阻断棕榈酰化。p65棕榈酰化-去棕榈酰化循环较慢，半衰期超过20 h，可能与其位点位于NF-κB复合物界面有关。靶向反应性半胱氨酸是转录因子靶向策略之一，licochalcone D可作为研究p65棕榈酰化功能的工具化合物。局限性包括：棕榈酰化促进p65-p50相互作用和核转位的结构证据主要基于AlphaFold3预测模型而非实验解析的棕榈酰化p65-p50共晶或冷冻电镜结构；体外重组系统测得的K_m等参数可能不完全反映天然细胞环境；不能排除未测试的zDHHC、zDHHC冗余或特定细胞类型中的酶促调控；HFD小鼠组织中的相关性并非因果，需p65 2CS敲入小鼠验证；licochalcone D作为天然产物可能作用于其他靶点，且未测试其对TEAD或RFX3等其他自棕榈酰化蛋白的选择性；功能研究主要基于p65 KO HEK293A重建系统和PMA分化THP1细胞，原代免疫细胞及体内调控关系尚待建立。

研究结论翻译：这些结果表明，脂肪酸代谢可通过p65棕榈酰化直接调节NF-κB活性，并提示靶向p65自棕榈酰化可能成为NF-κB信号失调疾病的治疗策略。总之，研究人员的工作提示p65棕榈酰化可能是脂质代谢与炎症之间的机制联系，靶向该过程可能成为NF-κB活性失调疾病的治疗策略。