《Diagnostics》：CRISPR/Cas-Based Molecular Diagnostics for Intestinal Parasites: From Proof-of-Concept to Point-of-Care Testing
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肠道寄生虫感染仍然是全球重大公共卫生问题，尤其是在低收入和中等收入国家，及时且准确的诊断对于有效的疾病管理和控制至关重要。尽管常规诊断方法，包括显微镜检查、抗原检测和聚合酶链反应（PCR），被广泛使用，但每种方法在灵敏度、周转时间、实验室基础设施或即时检测适用
肠道寄生虫感染仍然是全球重大公共卫生问题，尤其是在低收入和中等收入国家，及时且准确的诊断对于有效的疾病管理和控制至关重要。尽管常规诊断方法，包括显微镜检查、抗原检测和聚合酶链反应（PCR），被广泛使用，但每种方法在灵敏度、周转时间、实验室基础设施或即时检测适用性方面均存在固有局限性。聚集规则间隔短回文重复（CRISPR）/CRISPR相关（Cas）系统的最新进展已推动开发出适用于分散化检测的高灵敏度和快速分子诊断平台。本综述总结了基于CRISPR/Cas的诊断技术在肠道和食源性寄生虫感染中的当前应用，特别强调针对十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）、微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）、华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）、肝片吸虫（Fasciola hepatica）和血吸虫属（Schistosoma spp.）开发的检测方法。已发表研究主要采用Cas12a，另有Cas12b、Cas13a以及最近的一种I-A型Cascade–Cas3系统的应用，通常与重组酶聚合酶扩增（RPA）或重组酶辅助扩增（RAA）等等温扩增方法偶联，可在60–90分钟内通过荧光或侧向层析试纸读数实现高灵敏度检测。现有证据表明其具有较高的分析灵敏度和特异性，若干检测方法与常规分子方法表现出高度一致，并具有即时检测开发潜力。然而，当前基于CRISPR的检测方法仍受限于对核酸提取的依赖、临床验证队列相对较小、缺乏标准化方案，以及与低寄生虫载量和分析前变量相关的假阴性结果持续存在。新兴策略，包括简化或免提取样品制备、一管式样本到答案平台，以及检测寄生虫来源的游离DNA（cfDNA），可能进一步增强CRISPR诊断的临床实用性。总体而言，CRISPR/Cas技术代表了肠道寄生虫诊断中一种有前景的下一代方法，但在常规临床和现场环境中广泛实施之前，仍需要进行大规模临床验证和工作流程优化。
1. 引言（Introduction）
肠道寄生虫分子诊断的有效性受多种关键因素影响，最显著的是寄生虫丰度、DNA提取效率和检测方法灵敏度。已有研究表明，低寄生虫载量即使在使用高度先进的分子工具时也会显著降低检测灵敏度。DNA提取步骤尤为关键，裂解或纯化不充分可导致DNA回收率低并产生假阴性结果。粪便样本常含有多种抑制物质，这些物质可能在提取过程中共纯化并干扰下游PCR扩增。此外，细胞裂解不完全和DNA片段化也会损害分子检测的效率和可靠性。现有诊断方法在分析灵敏度、基础设施要求、周转时间和即时检测适用性之间需要权衡。尽管分子诊断取得了进展，常规诊断仍严重依赖传统显微镜检查，而分子方法受限于设备要求以及粪便样本核酸提取的挑战。CRISPR/Cas诊断因此可能为开发更适合肠道寄生虫检测的标准化、灵敏且可及的分子方法提供机会，目前研究重点已转向将等温扩增技术与CRISPR/Cas系统整合，以构建快速、便携且高灵敏度的诊断平台。
2. 文献检索策略（Literature Search Strategy）
本综述采用叙述性文献检索，使用PubMed Central（PMC）、ScienceDirect和Google Scholar数据库，检索关键词组合包括“CRISPR”“Cas12”“Cas13”“Cas3”“肠道寄生虫”“寄生虫感染”“诊断”和“即时检测”。最终文献检索于2026年9月1日进行。纳入标准为研究CRISPR检测肠道寄生虫的文献，包括人类临床标本、动物样本以及具有医学重要性的食源性寄生虫。仅涉及非肠道寄生虫或与人类肠道感染无关的研究被排除。对纳入研究评估其诊断方法学、分析灵敏度、临床验证情况以及即时检测适用性。
3. CRISPR/Cas诊断原理（CRISPR/Cas Diagnostic Principles）
CRISPR/Cas系统与等温扩增技术的整合显著推动了快速、灵敏分子诊断检测的发展。重组酶聚合酶扩增（RPA）在等温条件下（37–42 °C）扩增核酸，无需热循环。与需要反复变温和精密热循环仪的常规PCR不同，RPA依赖重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换聚合酶，通常在15–30分钟内完成快速扩增。与CRISPR/Cas系统结合时，RPA提供快速靶标扩增，而序列特异的CRISPR介导识别随后通过荧光或侧向层析读数实现检测。与环介导等温扩增（LAMP）相比，RPA工作温度较低，引物设计更简单，通常只需两条引物，因此更易与Cas12a等CRISPR效应器整合。典型的CRISPR/Cas12a检测包括Cas12a蛋白、靶标特异的CRISPR RNA（crRNA）和标记的单链DNA报告分子，通常与上游扩增反应偶联。Cas12a–crRNA复合物识别靶标DNA中与原型间隔区相邻基序（PAM）兼容的序列后发生构象激活，并非特异性切割周围单链DNA报告分子，产生可检测信号。基于此，DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告（DETECTR）平台整合了RPA扩增与Cas12a检测，可在30–60分钟内完成，设备要求低，适合资源有限环境及现场监测。
4. CRISPR/Cas在肠道寄生虫诊断中的应用（CRISPR/Cas Applications in Intestinal Parasite Diagnosis）
最早的肠道寄生虫CRISPR诊断平台由Yu等人开发，即针对微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）IId亚型家族的RPA–CRISPR/Cas12a（ReCTC）检测。该检测靶向高度多态的gp60基因，通过荧光和侧向层析试纸产生信号，分析灵敏度达1个靶标DNA拷贝或1个卵囊/mL，与其他隐孢子虫亚型及常见肠道原虫无交叉反应。临床验证使用犊牛和人粪便样本，与巢式PCR和测序结果完全一致。研究中还引入基于N-十二烷基肌氨酸钠（LSS）的粗制DNA提取方案，降低了对外购提取试剂盒的依赖。
Huang等人将CRISPR诊断扩展至食源性吸虫华支睾吸虫（Clonorchis sinensis），其Cas12a-RPA检测靶向ITS1区域，使用人粪便和感染鱼类样本进行评价，分析灵敏度为1个DNA拷贝/μL，与巢式PCR完全一致，双荧光和侧向层析检测格式展示了实验室和现场应用的通用性。
MacGregor等人采用基于Cas13a的SHERLOCK平台诊断日本血吸虫（Schistosoma japonicum）和曼氏血吸虫（S. mansoni），对曼氏血吸虫的检测限低至0.001 pg/μL，并证明该检测适用于粪便和血清样本。但该工作流程相对复杂，需要额外处理步骤。
Yang等人开发了靶向肝片吸虫（Fasciola hepatica）线粒体COX1基因的Cas12a-RPA检测，使用羊和人粪便样本验证，分析灵敏度为0.122拷贝/μL，与常规分子方法高度一致，且与相关寄生虫无交叉反应。Li等人采用Cas12b偶联重组酶辅助扩增（RAA）检测肝片吸虫，分析灵敏度为2.6拷贝/μL，虽然略低于Cas12a，但证实了替代Cas效应器的可行性。
针对十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis），Zhao等人开发了Cas12a-RPA检测，在人和牛粪便样本中检出该寄生虫，检测限为10
-1拷贝/μL，与九个常见肠道病原体无交叉反应，临床评估与巢式PCR完全一致。Wang等人引入REPORT平台，靶向tpi基因区分临床重要的贾第虫聚集型A和B，成功识别了数个测序无法确认的阳性临床样本，提示CRISPR检测可能发现低水平感染。
此外，针对粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）的RPA–CRISPR/Cas12a检测实现了500 fg/mL的检测限，但在6个qPCR阳性粪便样本中仅检出3个，突显优化需求。2026年，一项针对华支睾吸虫的一管式RPA–Cascade–Cas3检测在32份自然感染的鱼类样本中与PCR高度一致，约60分钟完成，但尚未在人临床样本中验证。
5. CRISPR/Cas效应系统的比较（Comparison of CRISPR/Cas Effector Systems）
Cas12a已成为肠道寄生虫分子诊断的主要平台。Cas12a识别靶标双链DNA中与PAM相邻的序列后，对单链DNA报告分子产生非特异性顺式切割，实现信号放大。其工作温度约37 °C，与RPA最适温度接近，便于整合至简化工作流程，并可通过荧光或侧向层析试纸快速判读。目前已成功应用于微小隐孢子虫、华支睾吸虫、肝片吸虫和十二指肠贾第虫的检测。
Cas13a靶向RNA，在识别RNA后切割周围单链RNA，构成SHERLOCK平台。Cas13a具有极高的分析灵敏度，适合低载量或循环核酸检测。但该类检测通常需要T7 RNA聚合酶进行体外转录，将扩增DNA转换为RNA，增加了工作流程的复杂性和酶组分，因此更适合集中化实验室而非常规即时检测。
Cas12b同样识别双链DNA并切割单链DNA报告分子。部分Cas12b直系同源物的最适温度较高，可能给与RPA/RAA直接整合带来困难，但工程化反应条件和一管式设计可实现兼容。目前仅有一项研究将Cas12b用于肝片吸虫检测，但该整合证明了简化闭管诊断平台的可行性。
Cas3属于1类I型CRISPR系统，与多亚基Cascade复合体协同作用，实现序列特异性靶标识别和广泛DNA降解。此前已有Cas3操作核酸检测（CONAN）平台用于SARS-CoV-2检测。近期一项研究开发了一管式RPA–Cascade–Cas3检测华支睾吸虫，检测限为1拷贝/μL，约60分钟完成，并具有扩展的PAM识别能力。
6. 技术与临床局限性（Technical and Clinical Limitations）
假阴性结果仍然是主要关注点，可源于低寄生虫载量、核酸提取效率低下、靶标DNA降解或丢失、靶区域序列变异以及预扩增效率不稳定。粪便来源DNA尤其具有挑战性，抑制物和低丰度寄生虫DNA回收不足可影响下游扩增。粪类圆线虫检测正是分析灵敏度与临床性能差异的例证，其分析检测限虽低，但在临床样本中检出率不高。靶标选择因此至关重要，保守区域和PAM序列可减少序列变异影响，多拷贝靶标可能提高低强度感染灵敏度。
现有研究中未报告假阳性结果，但需谨慎解读，因为样本量小且非靶标生物panel有限。非特异性RPA/RAA、扩增产物交叉污染、crRNA意外识别近缘序列、报告分子不稳定或侧向层析信号模糊均可能导致假阳性。应通过保守靶标选择、引物和引导RNA优化、近缘生物测试、阴性对照以及闭管或一管式工作流程加以控制。
此外，现有证据基础仍有限。多数研究为概念验证，临床队列规模小，缺乏多中心验证和与已确立的多重PCR的直接比较。已覆盖的寄生虫种类有限，许多临床重要肠道原虫和蠕虫尚未被探索。尚无检测获得监管批准或通过WHO正式评估。再者，大多数检测仍需要DNA提取，尚无研究在实际现场条件下验证。简化样本制备的努力包括LSS粗提法和DAP缓冲液快速处理，但后者仅在鱼类样本中评估。另一个有前景的方向是检测血清或血浆中寄生虫来源的游离DNA（cfDNA），但静脉采血仍属有创取样。
7. 即时检测转化与未来展望（Point-of-Care Translation and Future Perspectives）
按照ASSURED和REASSURED标准，当前肠道寄生虫CRISPR检测在分析灵敏度和特异性方面表现优秀，并具有等温扩增、便携式读数和低设备需求等即时检测特征。然而，多数平台仍受限于粪便样本采集和处理、核酸提取依赖、多步骤工作流程、检测周期约60–90分钟、试剂稳定性、实时连接性不足以及缺乏大规模现场验证。未来应致力于开发全集成样本到答案平台，结合简化或免提取样本制备、一管式扩增与检测、便携式或智能手机读数系统，以及稳健的临床验证。冻干技术是提高试剂稳定性、减少冷链依赖的有前景策略。多重CRISPR平台可同时检测并区分多种肠道寄生虫，其在病毒诊断中已有成功示例。无扩增CRISPR方法可消除预扩增步骤并降低交叉污染风险，但肠道寄生虫临床标本中核酸丰度较低，可能需改进信号放大和目标富集策略。
8. 结论（Conclusions）
CRISPR/Cas技术在改善肠道寄生虫感染诊断方面具有巨大潜力，特别是在资源有限和流行地区。将CRISPR/Cas系统与等温扩增、简化核酸提取和便携式检测方法整合，是实现快速可及分子诊断的重要一步。尽管分析性能令人鼓舞，但多数现有检测仍处于概念验证阶段，临床验证有限，并存在技术和操作挑战。未来研究应优先开发全集成、免提取、样本到答案平台，整合稳定试剂、简化工作流程、多重检测和低成本读数系统。大规模多中心临床验证以及与既定诊断方法的标准化比较，将是证明其可靠性和临床效用的必要条件。
