扣带回后皮层投射组织的单神经元水平解析

《Cell Reports》：Organization of retrosplenial cortex projections at the single-neuron level

　　

扣带回后皮层（retrosplenial cortex，RSP）支持空间认知、记忆和全脑信息整合，但其输出架构在单神经元分辨率水平仍未得到清晰解析。研究人员利用荧光显微光学切片断层成像（fluorescence micro-optical sectioning tomography，fMOST）技术，在全脑范围内重建了主要采自RSP前部的稀疏标记神经元。研究人员发现了三条主要投射通路——皮层限制型（cortical-restricted，CR）、丘脑限制型（thalamic-restricted，TR）和丘脑-脑干侧支型（thalamic-brainstem collateral，TBC），并根据不同的靶点选择性特征将神经元分为十个投射亚型。胞体位置和体积特征与轴突投射模式相关。TR模式神经元表现出亚区依赖的丘脑靶向投射，而TBC模式神经元则表现出更高的轴突复杂度以及针对丘脑、中脑和后脑靶点的亚型特异性侧支化。不同投射模式中的双侧投射神经元呈现跨网络投射模式，总体具有同侧偏好和层特异性的连合架构。综上所述，这些发现提供了RSP皮层、丘脑及皮层-皮层下输出模式的单神经元解剖图谱，并为研究全脑网络中分布式信息处理提供了框架。

扣带回后皮层（retrosplenial cortex，RSP）作为联合皮层的重要枢纽，连接多种皮层和皮层下系统，参与空间认知、记忆巩固、状态依赖处理及睡眠相关的脑状态调控。RSP功能的多样性被认为依赖于单个神经元如何将输出分配到多个下游靶区，而非单一的投射通路。然而，传统群体水平示踪难以分辨单个RSP神经元的轴突走向、侧支分支及靶区组合；尤其对RSP-丘脑投射究竟是单一经典通路还是多种结构上可分离的模式，一直缺乏直接证据。因此，需要在单神经元分辨率下系统解析RSP的输出架构。

研究人员利用荧光显微光学切片断层成像（fluorescence micro-optical sectioning tomography，fMOST）全脑高分辨率成像技术，对主要采自前部RSP的稀疏标记神经元进行三维重建，共获得396个神经元，其中363个通过质量控制纳入分析。基于轴突末梢分布和侧支化模式，将神经元分为皮层限制型（cortical-restricted，CR）、丘脑限制型（thalamic-restricted，TR）和丘脑-脑干侧支型（thalamic-brainstem collateral，TBC）三条主要投射通路，并进一步划分出10个投射亚型。研究表明，TR与TBC是两类结构可分离的丘脑相关投射模式；体细胞位置、层状分布和体积特征与轴突复杂度及靶区偏好存在关联；双侧投射神经元总体呈同侧偏好，并具有层特异性的连合投射架构。这些发现为RSP的皮层、丘脑及皮层-皮层下输出模式提供了单神经元水平的解剖图谱。

研究人员使用成年雄雌小鼠，来自CaMKIIα-Cre、Thy1-Cre、Vgat-ires-Cre、Som-Cre、PV-Cre和VIP-Cre共6种Cre转基因系，在单侧RSP立体定位注射CSSP-YFP-8E3病毒实现稀疏标记。4周后脑组织经HM20树脂包埋，利用HD-fMOST系统以0.32×0.32×1 μm³体素分辨率完成全脑成像。用GTree软件半自动追踪重建单个神经元形态，并配准到Allen小鼠脑公共坐标框架第3版（Allen CCFv3）进行亚区和层状定位。形态量化采用MATLAB和Python完成，使用主成分分析定义形态复杂度评分，用区域选择性指数（regional selectivity index，RSI）衡量靶区偏好，统计方法包括单因素方差分析、Fisher精确检验和Benjamini-Hochberg校正。全部重建神经元数据已发布于在线可视化平台。

重建RSP神经元的投射模式：通过对363个质量控制后神经元的全脑轴突轨迹分析，发现大多数神经元投向新皮层区域（如初级运动皮层MOp、次级运动皮层MOs、初级躯体感觉区SSp、前扣带区ACA、视觉区VIS）及丘脑、中脑、后脑等皮层下结构，并识别出CR、TR、TBC三条主要投射通路，其中TBC神经元在下丘脑附近分叉，分别投向中脑上丘和后脑海桥被盖等区域。

RSP投射亚型的分类与空间组织：依据主轴突轨迹、主要分叉位点、侧支方向及靶区组合，将三条通路的神经元细分为10个亚型。层流分析显示CR神经元分布于L1-L6，TR神经元高度集中于L6A/L6B，TBC神经元主要在L5/L6A。形态学比较发现TBC神经元体细胞体积最大、轴突复杂度和分支数目显著高于TR和CR神经元；主成分分析得到的形态复杂度评分在不同投射通路之间有明显分离。

TR模式神经元的靶回路：TR神经元在多个丘脑核团（如外侧背核LD、前腹核AV、外侧后核LP、丘脑网状核RT、腹后外侧核VPL、丘脑后复合体PO等）有密集末梢。RSI分析和三维重建显示，RSPv神经元的丘脑通路较弥散且部分路径更长更弯曲，RSPd和RSPagl则相对集中；RSPv和RSPd对LD有显著偏好，RSPagl轴突主要穿行LD/LP。在层状分布上，TR神经元主要位于L6A/L6B，L6A神经元的顶树突复杂度显著高于L6B；RSPagl神经元的树突末梢向运动皮层等区域扩展得更广。

TBC模式神经元轴突侧支的选择性偏好：TBC神经元根据皮层和皮层下共投射组合分为5个亚型（亚型6-10），不同亚型体细胞在RSP内交织分布但侧支形态不同；亚型10具有最大的轴突总长和分支数。在下丘脑附近的分叉中，亚型10经多重比较校正后对中脑前顶盖核（APN）和中脑导水管周围灰质（PAG）有显著靶点偏好。约68%的TBC神经元穿越丘脑而未形成可检测的丘脑分支；30个有丘脑侧支的神经元可进一步分为直接型、迂回型和分层型三种分支模式，三者在层状分布上也存在偏好。

CR模式亚网络的拓扑组织：CR神经元按投射到躯体感觉运动、内侧和外侧三个皮层网络的情况分为3个亚型：亚型2主要投向内侧网络，亚型3投向体感运动网络和内侧网络，亚型4广泛投射到双侧新皮层并延伸至内嗅区等旁海马结构。层流分析显示亚型2主要位于L2/3，亚型4在L2/3-L6分布更广且非均匀；亚型4的轴突总长显著大于亚型2和亚型3，但末梢数和分支数无显著差异。局部环路GABA能神经元（亚型1）中，L2/3马丁诺蒂细胞（19.7%）、L6A水平延长细胞（19.0%）、L5神经胶质样细胞（17.7%）和L2/3篮状细胞（12.2%）为主要类型，各类型间体细胞体积大多接近。

双侧投射神经元的半球间连接特征：同侧偏好神经元更多位于深层L5-L6，对侧偏好神经元则多在L2/3-L5；RSPd贡献了最多（64%）的双侧投射神经元。多数双侧神经元呈同侧偏好，少数连接显示对侧偏好。按连合通路分类，胼胝体投射占76%（简单型15%、复杂型61%），海马连合投射占9%，前连合投射占15%；各连合通路神经元在层状分布、轴突终末侧向性和靶区结构上各有特征。

讨论指出，TR与TBC两类丘脑相关结构模式的分离提示RSP-丘脑输出并非单一通路，而TBC神经元对中脑、后脑多个与睡眠调控有关区域（如APN、PAG）的靶向性，结合RSP在快速眼动睡眠中的已知作用，提示这类通路可能参与快速眼动睡眠的启动与维持；CR亚型与TBC亚型在皮层信息层级处理中可能互补；体细胞位置、体积与轴突形态之间的关联提示位置依赖的发育和轴突导向机制。研究的结论为：本研究在单神经元水平上开展投射组分析，为所分析的神经元群体定义了投射组织的解剖框架，为后续验证投射通路、亚区或层状位置及轴突复杂度与RSP功能之间的关系奠定了基础。