单细胞转录组学研究揭示了人类视网膜神经元移植到小鼠视网膜后小胶质细胞/巨噬细胞的可逆激活过程

《iScience》：Single-cell transcriptomics reveals reversible microglia/macrophage activation after human retinal neuron transplantation into mouse retina

　　**研究亮点**
- 人视网膜神经节细胞（RGC）移植后，宿主髓系细胞会形成动态状态
- 移植诱导了类似疾病相关小胶质细胞（DAM）的Apoe/Spp1/Lgals3激活程序
- RNA速度分析揭示了小胶质细胞的双向激活和恢复轨迹
- 可以通过RNA速度输出研究细胞分化过程

**摘要**
宿主视网膜中的小胶质细胞和巨噬细胞可能会限制移植后供体神经元的存活和整合，但这种反应背后的细胞机制仍不明确。在本研究中，我们使用了源自Brn3b-tdTomato-Thy1.2的视网膜类器官的人胚胎干细胞衍生的视网膜神经节细胞，并将其移植到健康的CX3CR1GFP小鼠的视网膜下层。三天后，通过荧光激活细胞分选技术分离出GFP阳性的宿主髓系细胞，并利用10×单细胞RNA测序对其进行了分析，免疫组化进一步验证了空间和分子变化。转录组及RNA速度分析显示，小胶质细胞/巨噬细胞经历了包括稳态、短暂激活、增殖和激活等多个阶段。移植诱导了类似疾病相关小胶质细胞的反应，表现为Tmem119基因表达降低，而Apoe、Lgals3、Spp1、Cybb等相关激活基因表达增加。综合分析表明，这种反应与视网膜和神经退行性疾病中的髓系细胞状态有关。重要的是，从稳态到激活以及从激活回到稳态的轨迹表明，移植诱导的宿主髓系细胞激活是一个动态且部分可逆的过程，这对未来视网膜细胞治疗具有启示意义。

**引言**
视网膜神经节细胞（RGC）在将视觉信号从视网膜传递到大脑的过程中起着关键作用。包括青光眼、非动脉性前部缺血性视神经病变、Leber遗传性视神经病变、创伤性视神经病变和视神经通路胶质瘤在内的多种视神经病变都会导致RGC损伤，最终导致其死亡。由于哺乳动物RGC无法再生，因此RGC的丧失是永久性的。针对这些视神经病变的神经再生策略主要集中在恢复受损的RGC细胞群体上。为了实现功能再生，移植的RGC必须在视网膜和大脑中存活、整合并延伸轴突并建立连接。在影响供体RGC存活的众多因素中，先天免疫反应尤其是小胶质细胞的反应性备受关注。在青光眼及其他视神经病变的动物模型中，小胶质细胞被证实会促进疾病进展并形成炎症环境。我们的最新研究表明，激活的宿主小胶质细胞对供体RGC的存活有害，可能是通过吞噬受损的RGC来实现的。我们发现，在移植前用sFasL和Annexin V处理供体RGC以阻断其暴露的磷脂酰丝氨酸残基，可以减少宿主小胶质细胞的激活，并提高移植后的RGC存活率。这类研究强调了调节宿主小胶质细胞反应性以改善移植效果的重要性。

**为进一步提高移植后供体RGC的存活率，深入了解移植后宿主髓系细胞的反应性至关重要。在本研究中，我们利用单细胞RNA测序技术分析了宿主髓系（CX3CR1GFP）细胞的转录组，以详细了解单个细胞的反应情况。我们对小胶质细胞群体进行了专门分析，并将其与我们在本研究中构建的健康成年小鼠视网膜细胞图谱进行了比较。结果显示，移植后的小胶质细胞上调了与疾病相关的小胶质细胞基因（如Apoe、Spp1和Lgals3），这些基因通常与大脑和视网膜的神经退行性疾病相关。此外，我们还发现了几种与小胶质细胞激活相关的其他基因（如Cybb、Atf3、Aurka和Kif22）。鉴于这些基因在其他疾病中的已知功能，我们认为它们在调节移植后供体RGC的存活方面起着重要作用，因此需要进一步研究。总之，我们提供了关于移植后宿主髓系细胞的全面分析，特别关注小胶质细胞的反应性，并探讨了可能影响供体RGC存活和整合的调控机制。**

**健康成年小鼠视网膜图谱**
我们收集、分析了多个来自健康成年小鼠视网膜的公共单细胞RNA测序数据集，建立了一个“健康成年小鼠视网膜图谱”（可在网页浏览器中查看：https://cellxgene.cziscience.com/e/3375d9f3-e17b-46da-b40e-ec6e1779ad88.cxg/），该图谱涵盖了从出生后第4周到52周龄的小鼠样本（图1A和S2）。通过使用不同的细胞标志物（如Tfap2a、Tfap2b、Onecut2、Grik1、Vsx1、Vsx2、Pde6h、Cx3cr1、Tmem119、Rlbp1、Gap43、Rbpms、Pou4f2、Isl1、Nrl、Nr2e3、Pde6b、Rcvrn、Rpe65、Emcn和Pdgfrb等），识别出了主要的视网膜细胞类型。

**图1** 健康成年小鼠视网膜图谱展示了不同时间点上视网膜细胞类型的高分辨率
- (A) UMAP嵌入显示了健康成年小鼠视网膜图谱中的主要细胞类型（373,651个细胞）。
- (B) 点图展示了图谱中确定的细胞类型的典型标志物。
- (C) 特征图显示了表达特定标志物的细胞。
- (D) 积分图显示了细胞的相对和绝对数量、时间点分布以及相关公共数据集的标识符。

当按照生物时间点对整合数据进行分层时（图1D），不同时间点上的细胞类型构成有所不同。例如，在整个时间线中，杆细胞始终占据视网膜神经元的最大比例。为了更高效地进行分析，我们将数据重新分类为三个主要时间段（图S2）：
- **年轻成年期（≤14周岁）**
- **成熟成年期（15至21周岁）**
- **老年期（>35至43周和52周岁）**
这种重新分类保持了足够的分辨率，便于进行深入的细胞亚群分析和细胞间相互作用研究（图S3）。即使在重新分类后，主要的细胞类型仍然保持一致。免疫/髓系/淋巴细胞群体在三个时间段的数量分别为：年轻成年期9,979个、成熟成年期205个和老年期773个。这1,0957个免疫/髓系/淋巴细胞代表46个不同的批次（图2A）。为了在整合的成年小鼠视网膜图谱中组织免疫/髓系/淋巴细胞亚群并识别转录上不同的亚群及其标志物程序，我们进行了细胞命运轨迹重建（图2B）。重建的结果显示了两个潜在的细胞命运分支，最终形成了三种细胞亚群：树突状细胞、T细胞和小胶质细胞/巨噬细胞（图2C）。第一个分支由Cxcl10+ Ccl2+ Tnf+定义，将免疫细胞与由Il1b+ Cybb+ Lyz2定义的小胶质细胞/巨噬细胞分开；第二个分支在免疫细胞群体内进一步细分为树突状细胞（Ccr7+）和T细胞（Cd3e+ Cd3g+ Ccl5+ Il1b+）（图2D）。这使我们能够在健康成年小鼠视网膜图谱中明确这些亚群及其独特的标志物，为未来研究移植后的宿主小胶质细胞提供参考。

**宿主小胶质细胞对RGC移植的反应**
移植后，我们分离出宿主视网膜中的髓系细胞并进行了单细胞RNA测序（图S1）。经过过滤和质量控制后，共获得了2,814个细胞。为了确定髓系细胞中的小胶质细胞/巨噬细胞，我们使用了之前建立的成年小鼠视网膜图谱（链接：https://cellxgene.cziscience.com/e/3375d9f3-e17b-46da-b40e-ec6e1779ad88.cxg/）作为参考图谱。通过RNA速度分析，我们发现细胞在嵌入过程中表现出连续的激活状态（图3A）。根据表达谱，识别出三种髓系细胞状态：稳态、增殖和激活状态（分别对应轨迹的“顶端”和“底部”）。我们观察到细胞具有双向分化能力：处于稳态的细胞可以转化为激活状态，而处于激活状态的细胞也可以回到稳态。重要的是，这些轨迹由不同的转录程序决定，在嵌入图中没有明显重叠。稳态和激活状态分别由已知与小胶质细胞状态相关的基因定义（图3B）。

**RNA速度分析揭示的小胶质细胞的双向激活趋势**
通过RNA速度分析，我们发现细胞在稳态和激活状态之间可以双向转化。处于稳态的细胞可以转变为激活状态，而处于激活状态的细胞也可以恢复到稳态。这些轨迹表明，宿主小胶质细胞的激活是一个动态且部分可逆的过程。从激活状态向稳态状态的转变（图3H）表现为与激活的小胶质细胞相关的基因（如Lgals3、Spp1、Cybb和Apoe）表达的抑制；而从稳态状态向激活状态的转变则表现为小胶质细胞稳态基因P2ry12表达的抑制，同时与小胶质细胞激活相关的基因Apoe表达的上调（图3I）。为了定量评估细胞向激活状态（preCSa）或稳态状态（preCSh）的倾向，并分析这两种状态之间的平衡，我们引入了一个数值“承诺得分”（CS），该得分总结了朝向稳态或激活状态的RNA速度向量。代表稳态和激活状态的小胶质细胞承诺分布的累积速度得分显示在图3J中。这些得分进一步被分为两类：稳态向激活状态和激活状态向稳态状态，并且针对这两种轨迹分别量化了preCSa和preCSh得分（图3K和3L）。累积速度/承诺得分用于总结RNA速度向量在激活和稳态极点之间的方向平衡。这些图表量化了在移植后分析的时间点，髓系细胞群是更倾向于激活还是更倾向于恢复到稳态转录状态。这为轨迹分析和标记物表达分析提供了定量补充，并支持我们的观点，即移植后的宿主髓系细胞激活是动态的，并且至少部分是可逆的。我们探讨了小胶质细胞/巨噬细胞群体的状态承诺得分（CS），作为稳态和激活承诺得分的比率。未标准化承诺得分（unCS）的值为9.335。我们通过评估每种状态中的细胞数量来标准化这个值。标准化承诺得分（nCS）的值为8.066，表明细胞群体的一般趋势显著偏向稳态状态。细胞向稳态状态的承诺是向激活状态的8.066到9.335倍。

在人类视网膜异种移植人视网膜神经节细胞（RGCs）后，通过免疫组化验证了在从稳态到激活状态和从激活状态到稳态状态过程中表达变化的基因的差异。在移植后三天，对视网膜整体进行染色，检测Spp1、Tmem119和Apoe的表达（图4A–4K和4O–4U）。在注射部位附近，我们观察到宿主GFP+髓系细胞密度的局部增加以及形态的变化。注射tdTomato+ hESC衍生的RGCs后，Cx3cr1-GFP+髓系细胞（小胶质细胞和巨噬细胞）的密度局部增加，稳态小胶质细胞的特征性形态（如分支结构）和标记物Tmem119的表达丧失。

通过免疫组化观察到的空间分布与scRNA-seq检测到的异质性一致。由于GFP阳性的髓系细胞是从整个移植的视网膜中纯化的，因此测序的群体可能包括集中在注射部位附近的激活小胶质细胞/巨噬细胞，以及来自视网膜远端区域的更稳定的小胶质细胞。单细胞分析中观察到的从稳态到激活状态的转录连续性至少部分反映了宿主髓系细胞对移植的供体RGCs和局部损伤信号的空间异质性暴露。与注射部位较远的同一类型细胞相比，宿主髓系细胞的形态较少分支且更呈变形虫状。在注射部位，稳态小胶质细胞的标记物Tmem119的表达不存在，但在视网膜其他地方的枝状小胶质细胞中存在；而DAM标记物Spp1则在注射部位的GFP+髓系细胞中表达，在其他地方则不存在。进一步的免疫组化研究（O–U）显示，在注射部位，包括视网膜表面下的变形虫样GFP+髓系细胞中，Apoe的表达局部增加。比例尺 = 100 μm（A, B, G, 和 O–U），50 μm（C–F, H–K）。条形图表示Tmem119+Spp1-（34个细胞）与Tmem119-Spp1+（78个细胞）（L）以及Cx3cr1+ApoE-（159个细胞）与Cx3cr1+ApoE+（38个细胞）（M）的最大细胞范围。星号表示显著性p < 2.2e?16。测量中的细胞包括图中可见的细胞（A和O）。密度图展示了Tmem119+和Spp1+（N）、Apoe-和ApoE+（V）的小胶质细胞分布，按最大细胞范围分组着色。注射部位用星号（?）标记。实验重复次数 = 1。

在移植后分析的时间点，髓系细胞是否更倾向于激活或恢复到稳态转录状态。这为轨迹和标记物表达分析提供了定量补充，并支持我们的观点，即移植后的宿主髓系细胞激活是动态的，并且至少部分是可逆的。我们探讨了小胶质细胞/巨噬细胞群体的状态承诺得分（CS），作为稳态和激活承诺得分的比率。未标准化承诺得分（unCS）的值为9.335。我们通过评估每种状态中的细胞数量来标准化这个值。标准化承诺得分（nCS）的值为8.066，表明细胞群体的一般趋势显著偏向稳态状态。细胞向稳态状态的承诺是向激活状态的8.066到9.335倍。

在人类视网膜神经节细胞异种移植后，通过免疫组化验证了在从稳态到激活状态和从激活状态到稳态状态过程中表达变化的基因的差异。在移植后三天，对视网膜整体进行染色，检测Spp1、Tmem119和Apoe的表达（图4A–4K和4O–4U）。在注射部位附近，我们观察到宿主GFP+髓系细胞密度的局部增加以及形态的变化。注射tdTomato+ hESC衍生的RGCs后，Cx3cr1-GFP+髓系细胞（小胶质细胞和巨噬细胞）的密度局部增加，稳态小胶质细胞的特征性形态（如分支结构）和标记物Tmem119的表达丧失。WGCNA模块根据其无监督模块标识符进行标记。条件关联表明了每个模块在何种条件下显示出相对较高的模块得分/特征基因富集，但不应将其解释为唯一的条件身份。（C）多边形图展示了来自集成髓系数据集的模块在不同条件下的分布。在分析的路径中，GOBP_ACUTE_INFLAMMATORY_RESPONSE在青光眼条件下具有最高的NES，而GOBP_REGULATION_OF_MICROGLIAL_cell_ACTIVATION和GOBP_MICROGLIAL_CELL_PROLIFERATION在ONC条件下具有最高的NES。这种富集表明疾病条件下的小胶质细胞激活模式与宿主细胞对RGC移植的反应之间存在相似性（图6A）。进一步观察这些富集路径中的基因，发现它们表现出差异表达模式。在GOBP_ACTIVATION_OF_IMMUNE_CELLS路径中，有几个基因在宿主体内差异上调，包括：Sting1、Arrb2、Nlrp6、Nfkbil1、Mark4、Akt1、Myd88、TLr8和Sec1411（图S8）。这些基因在移植后的宿主视网膜中独特上调，但在MB诱导的青光眼模型、ONC模型以及发育过程中被抑制。因此，我们在图S8中提供了涉及这些基因的完整列表及其在条件间路径分析中的相对表达情况。

使用相同的数据集，我们进行了全基因组相关性网络分析（WGCNA），采用无监督方法。分析揭示了十二个HUT模块（图6B、6C、S5A和S7），其中HUT1特指健康（发育中和成年）状态，HUT3和HUT4特指发育状态，HUT6、HUT8、HUT9和HUT12特指移植后的宿主状态，HUT5和HUT10特指视神经压迫状态，HUT11特指移植后的宿主状态和MB诱导的青光眼状态。HUT11代表一个激活模块，其中包含几个枢纽基因，如Ccr2（一种对巨噬细胞和单核细胞募集重要的趋化因子受体）、Lgals1、Cybb、Lyz2和Apoe（这些基因与疾病中的小胶质细胞激活有关，图6C和S6）。该模块在移植后的宿主和青光眼状态下显著表达（图S5）。视神经压迫状态由HUT10表示，其中包含Junb、Egr1和Atf3等转录因子，这些因子调控其他多个基因的活性。健康状态（发育中和成年）由HUT1表征，其中包含Rp1、Sag、Rho、Tulp1和Pdc等基因，这些基因与视网膜发育疾病（如视网膜色素变性）有关。从移植后宿主状态评分最高的模块中，我们构建了枢纽基因网络（图S5B），其中HUT2、HUT6和HUT11形成了一个独特的簇，而HUT8和HUT9的基因形成了另一个簇。另一方面，HUT10特指ONC状态，包含一组与视神经压迫和参与视神经损伤、细胞死亡及存活相关的基因（Junb、即时早期反应基因Egr1、Atf3、Nfkb、Ier2、Ifrd1和Ppp1r15a）。

讨论
RGC通过移植的成功取决于多个因素，包括宿主微环境的状态。在这项研究中，我们旨在了解人类干细胞衍生RGC移植后宿主髓系细胞的反应。我们利用单细胞RNA测序、先进的整合转录组分析和免疫组化来表征宿主髓系细胞对RGC移植的反应。

大规模单细胞图谱整合及其应用
小鼠视网膜的单细胞数据集，包括Li等人开发的全面成年视网膜图谱，对于分析细胞类别和类型的转录特征至关重要。然而，它们不能代表罕见细胞类型（如小胶质细胞），且仅限于健康状态。为了全面理解发育和疾病，需要大规模图谱整合方法。在本研究中，我们构建了一个由多个公开可用的数据集组成的补充性、特定于研究的整合参考图谱。这使我们能够跨研究协调成年小鼠视网膜的转录组，并使用该图谱对我们的移植数据集进行基于参考的注释，重点关注髓系细胞群。与先前发布的资源相比，我们的图谱整合了更广泛的公共数据集，包含373,651个细胞，从而增加了跨研究、年龄、疾病模型和实验环境的代表性。这种整合结构对于我们后续分析移植后宿主髓系细胞与健康成年、发育中、青光眼相关和视神经压迫相关髓系状态进行了必要的对比。该图谱可用作多条件研究的控制数据集，或者作为分析其他单细胞RNA-seq数据集时的参考工具（例如，用于自动细胞注释）。使用此类图谱时应谨慎：尽管它允许研究基因表达和轨迹重建（当使用内置控制时，如线粒体、核糖体或MALAT1），但不应用于分析细胞群的频率或其老化。此外，该图谱还可以作为无需独立实验收集对照样本的“自然历史”组。这个跨越4至52周龄的小鼠对照成年视网膜图谱允许研究个别细胞类的成熟和老化过程。我们展示了集成图谱中的时间点连续性，这使得以细胞类为导向的研究成为可能：例如，用户可以子集无长突细胞类并探索随时间发生的转录变化。元数据（如性别、测序深度和平台）对于生物学和技术导向的研究都非常重要。一个例子是样本方差分析，现在可以在图谱内进行。

建立参考图谱后，我们根据图谱对单细胞RNAseq数据进行了注释。在本研究中，我们使用“髓系”一词来描述所有从视网膜收集的可能的髓系细胞群，包括Cx3cr1+细胞（小胶质细胞、驻留巨噬细胞、单核细胞衍生的巨噬细胞）、具有活化转录谱的Cx3cr1low激活细胞以及其他髓系细胞。由于小胶质细胞和巨噬细胞分析的复杂性，我们使用“小胶质细胞/巨噬细胞”这一术语来突出我们分析中的关注群体。由于本研究是功能导向和激活导向的，我们在细胞命运轨迹推断或其他下游分析中没有进一步区分小胶质细胞和巨噬细胞。

宿主小胶质细胞的细胞命运轨迹特征
在细胞轨迹分析中，我们确认了一个现有范式，即视网膜中的小胶质细胞/巨噬细胞群体是一个动态系统，系统中的每个细胞可以存在于“稳态”、“活化”或“过渡”状态。我们还分析了变化的连续性和双向性。这些特征与之前在健康野生型小鼠视网膜和微珠诱导的青光眼小鼠模型中的小胶质细胞研究结果一致，表明激活机制是灵活的、可逆的并且是双向的。先前展示的细胞命运轨迹重建方法表明该系统是可控的，稳态-激活的稳态是一个与条件相关的独特特征。应用细胞命运轨迹推断方法假设我们正在处理一个动态系统。在这里，我们应用RNA速度方法来重建宿主小胶质细胞/巨噬细胞群随RGC移植后激活谱的动态变化。由于髓系细胞在生命中的持续更新，健康成年视网膜的髓系细胞群也可以用类似策略进行分析。这创造了必要的动态性，允许基于效力进行去卷积，并应用scFates算法。

我们观察到小胶质细胞/巨噬细胞在稳态和激活状态之间的明确过渡状态。我们的分析表明存在两个过渡群体，代表了这些变化的方向性：从稳态到激活和从激活到稳态。尽管这两个群体在转录谱上非常相似，但欧几里得距离表明这些过渡程序是不同的，并不是以相反方向执行的同一程序。在我们的实验设计中，我们关注小胶质细胞/巨噬细胞的激活，预期变化是双向的。然而，我们注意到发现了包括促血管生成和IFN反应的小胶质细胞/巨噬细胞在内的多个群体。然而，我们观察到这些群体与其他小胶质细胞/巨噬细胞群体混合，表明小胶质细胞/巨噬细胞的激活潜力是普遍的且与功能无关的。进一步的高分辨率研究可以回答细胞状态转换的双向性问题。

本文还引入了“承诺得分”概念。对于小胶质细胞/巨噬细胞群体，它是基于双向承诺模型计算的：研究的细胞可以进入激活状态或稳态。然而，这一范式可以进一步扩展以定量描述多方向系统。例如，小鼠和人类的PAX6+视网膜前体可以产生无长突细胞、水平细胞和RGC。其他发育系统（如神经嵴、大脑、PBMC）可能包含来自同一前体状态的三种或更多最终细胞状态。在这种情况下，解决方案是构建力导向的布局（如ForceAtlas2），或应用顶点数等于最终状态的循环投影。这样，图表的每个部分在量化累积速度距离和测量承诺得分时将具有相同的权重。是否使用未标准化或nCS的决策应基于实验问题和设计。由于这两个指标之间的主要区别在于细胞数量的调整，了解这种细胞数量变化的原因很重要。这可能是真正的与条件相关的频率差异、样本变异或文库制备相关的问题。除非能够确定原因，否则真正的承诺得分值介于未标准化和标准化之间，其中更强的与条件相关的频率变化提示应更接近nCS值，而更强的与批次相关的频率变化可能与未标准化值相关。在实际情况中，可以使用额外的方法（如贝叶斯模型进行分析数据集组成）来找出频率变化的真正原因。

通过基于非已知小胶质细胞特异性基因的无监督聚类，我们确认了之前的观察结果，即Tmem119和P2ry12是稳态小胶质细胞的标志物。激活状态的特征是Apoe、Spp1、Lgals3、Lgals1、Cybb、Atf3、Cd74、Il1a和Apoebec1的上调，以及Tmem119和P2ry12的下调。有趣的是，这种激活表达模式与DAM（也称为神经退行性小胶质细胞（MGnD）非常相似，后者最初在阿尔茨海默病、多发性硬化症和肌萎缩侧索硬化症的背景下描述。同样的转录特征随后在青光眼和光感受器退化的小鼠模型以及人类青光眼和年龄相关性黄斑变性视网膜组织中也得到了描述。有趣的是，这些先前的研究表明，DAM/MGnD特征可以通过大脑和视网膜中凋亡或受损神经元的中小胶质细胞吞噬作用诱导。此外，在发育中的小鼠视网膜中也发现了类似的DAM样特征，这被认为是由发育适当的小胶质细胞消除多余凋亡的RGC引起的。因此，似乎在人类RGC移植后观察到的DAM样特征是由视网膜小胶质细胞吞噬移植的RGC引起的，调节这种髓系细胞反应可能提高移植RGC的存活率。

本文中应用的CellChat细胞-细胞交互分析在处理多批次数据时应谨慎进行。由于数据集（批次）的组成不同，调整细胞群的存在及其大小是很重要的。在我们的案例中，我们没有包括缺少任何主要视网膜类别的时间点，因为这会影响配体和受体的整体池，可能导致错误的结果。我们还排除了小胶质细胞/巨噬细胞数量较低的时间点。尽管如此，这些过滤器并不能保证真实反映细胞-细胞相互作用的情况。某些时间点可能因研究中的不同平台、测序深度或覆盖率而异常。在这种情况下，平均或分箱数据可能是克服噪声的解决方案。

GSEA路径和WGCNA分析使我们能够定量比较与炎症相关的多个信号通路及其在多种条件下的富集分数。我们的发现表明，人类RGC移植比视神经压迫或微珠诱导的青光眼更具压力，并且在所有条件下都是最强的。移植后，小胶质细胞/巨噬细胞上调MHC-I和MHC-II受体。他们的急性炎症反应与青光眼模型条件非常相似，但与视神经压榨模型不同。此外，在所研究的条件下，只有移植是导致小胶质细胞/巨噬细胞吞噬功能极强的唯一情况。然而，我们也证实了视神经压榨和青光眼模型中的小胶质细胞激活可能是视网膜神经节细胞（RGC）死亡的一个机制。相比之下，发育中的小胶质细胞/巨噬细胞的行为与其他任何研究过的条件都完全不同。与健康成人、青光眼模型或移植后条件不同，发育中的小胶质细胞/巨噬细胞的炎症潜能最低。我们包含了发育中视网膜的数据集，以进一步探讨已知的现象，即未成熟视网膜环境被认为对供体神经元的存活和整合更为有利。这种比较直接关系到核心问题：RGC移植后的宿主髓系细胞是否类似于稳态下的成年视网膜、损伤/疾病相关的视网膜或发育中的视网膜状态。我们的分析表明，在宿主小胶质细胞激活的背景下，发育中的视网膜是供体神经元最易接受的环境。因此，对于包括视网膜色素变性、Leber先天性黑蒙（LCA）、Stargardt病和锥杆细胞营养不良在内的多种遗传性疾病，如果缺乏其他治疗方法，将细胞移植到发育中的视网膜系统中可能是一个有前景的解决方案。此外，在发育中的视网膜系统中进行移植还允许进一步的基础研究：由于该环境可以延长供体神经突起的寿命，它们可能揭示其全部功能潜力（如果有的话），而不会因为移植或神经发生的再生不利环境而受到阻碍。

总体而言，我们的工作强调了调节宿主先天免疫系统（包括小胶质细胞和巨噬细胞）以改善神经元移植到视网膜中的重要性。先进的整合转录组学分析显示，视网膜小胶质细胞对神经元移植的反应比在RGC损伤模型中的反应更为显著和剧烈。然而，我们还使用伪时间分析证明了这一过程的可逆性，这为减少宿主髓系细胞的激活并恢复到稳态提供了一条分子途径。

研究的局限性：
1. 由于单个细胞数据集是在移植后3天的单一急性时间点收集的，因此无法明确区分从未被激活的细胞和之前被激活后又恢复到稳态的细胞。尽管RNA速度支持激活状态和稳态状态之间的双向移动，但要明确解决这些细胞的历史需要额外的时间点或谱系追踪方法。
2. 本研究仅关注移植后第3天的急性宿主髓系反应，未能解析供体细胞输送后前24小时内发生的最早分子事件。包括移植后第1天在内的更早时间点可能会提供有关抗原处理/呈现、吞噬信号传导和供体细胞丢失的更多见解。同样，需要对多个早期时间点的供体细胞存活进行纵向定量研究，以确定移植物清除的动力学。这些实验代表了未来研究的重要方向，但不在当前工作的范围内。
3. 由于没有包括匹配的假手术/载体注射对照组的scRNA-seq数据，本研究无法完全区分由供体RGC特异性诱导的转录程序和由注射相关的局部扰动诱导的转录程序。先前的视网膜研究表明，眼内注射本身就可以激活视网膜小胶质细胞和炎症信号传导，而在视网膜下和玻璃体内细胞移植研究中已经使用了假手术注射对照组来解释注射相关的效应。为了缓解这一限制，我们将移植后的宿主髓系细胞与多种公开可用的视网膜髓系状态进行了比较，包括健康成年视网膜、发育中的视网膜、视神经压榨和微珠诱导的青光眼。
4. 本研究没有关注性别相关变化。尽管提供了元数据，但我们没有进行任何关于性别与结果关联的实验。

资源可用性：
主要联系人：Petr Baranov ([e-mail])，可提供进一步的信息和资源。

材料可用性：
本研究未生成新的独特试剂。

数据和代码可用性：
• 本研究中生成的移植后宿主单细胞RNA测序数据已存放在GEO，并以GSE285564参考号公开，自发表之日起即可获取。
• 健康成年小鼠视网膜图谱可在CELLxGENE网站上获取：https://cellxgene.cziscience.com/collections/7dd7e8a1-f7c2-4213-9f23-dd52afb7ee16。有兴趣为未来版本的参考图谱贡献数据的研究人员应直接联系相应的作者。
• 本文分析了现有的、公开可用的数据，这些数据在表S1中进行了引用和描述。我们不对表S1中标记为在 manuscript 提交时未发布的原始数据主张任何作者权。
• 所有原始代码已存放在GitHub上，自发表之日起可在https://github.com/mcrewcow/neurons_transplantation_microglia公开获取。
• 如需重新分析本文报告的数据，可向主要联系人咨询。

致谢：
P.B. 获得了国防部VRP FTTSA VR220053项目、Gilbert家族基金会、MGB GCTI award的支持。A.M. 获得了青光眼基金会（TFG）和预防失明研究（RPB）的青光眼奖学金，该奖学金由Patricia Hill赞助。P.F.C. 获得了NIH/NEI的2T32EY007145项目资助。M.A.M. 获得了NIH/NEI的R01EY035312项目、Glaucoma Research Foundation的催化剂奖、Melza M. 和 Frank Theodore Barr基金会、Robert M. Sinskey医学基金会、Ruettgers家族慈善基金会以及B.L. Manger基金会的支持。D.F.C. 获得了国防部HT9425-23-1-1045项目和NIH/NEI的R01EY031696项目以及P30 EY003790项目的资助。

作者贡献：
E.K. 负责生物信息学分析、实验设计和作为第一作者。A.M. 负责组织分离、单细胞悬浮液制备、细胞分选和分选后群体的特征分析；文库制备和测序的物流工作。N.R. 负责细胞分化。V.V.M. 负责RGC移植和组织解剖以及组织学分析。E.K., S.V., N.B., 和 E.L. 负责公共单细胞RNA测序数据集的收集、解析和处理。P.F.C. 和 G.B. 负责免疫组织化学和成像工作。H.T.K. 和 E.K. 负责小胶质细胞图像分析和可视化。M.A.M. 和 P.B. 负责研究构思。所有作者都批准了最终的手稿。

利益声明：
P.B. 所有实验室均未参与任何利益相关事项。
M.A.M. 所有实验室均未参与任何利益相关事项。
D.F.C. 所有实验室均未参与任何利益相关事项。

**STAR★ 方法**
**关键资源表**LT-RDM每隔一天更换一次，直到使用Miltenyi Biotec的胚胎体分离试剂盒根据制造商的方案和gentleMACS分离协议（Brain_01和Brain_02）将视网膜类器官分离出来。人类RGC通过CD90.2 Dynabeads（Miltenyi Biotec，CD90.2 MicroBeads，小鼠）根据制造商的方案进行磁性微珠分选。

**人类ES来源的视网膜神经节细胞的体内移植**：
小鼠通过腹腔注射100 mg/kg盐酸氯胺酮和20 mg/kg盐酸赛拉嗪溶液（用生理盐水稀释）进行麻醉，直至完全镇静。使用1%托吡卡胺眼药水（Baush & Lomb Americas Inc., Bridgewater, NJ）扩瞳。在角膜表面滴入0.5%盐酸普鲁帕卡因眼药水（Bausch & Lomb Americas Inc., Bridgewater, NJ）2分钟。将RGC准备在N2B27培养基中[50:50的1× DMEM/F12：Neurobasal培养基，1% N2补充剂，2% B27补充剂，1× GlutaMAX和1×抗生素抗真菌剂]中，并加入负载BDNF和GDNF的PODS（Polyhedrin递送系统）。使用玻璃吸管，将含有15,000个活的tdTomato阳性人类ES来源RGC的1 μL溶液注射到每只小鼠的眼睛的视网膜下层。手术后，在注射的眼睛表面涂抹一滴新霉素、多粘菌素B硫酸盐和链霉素锌眼药水（Bausch & Lomb Americas Inc., Bridgewater, NJ）。

**小鼠视网膜分离、分离和单细胞悬浮液的制备**：
RGC移植三天后，小鼠被安乐死，取出注射过的眼睛进行眼球摘除并分离视网膜组织，立即转移到含有0.04%牛血清白蛋白（BSA）的冰浴磷酸盐缓冲液（PBS）试管中。将八个小鼠的视网膜合并形成一个样本。首先通过机械方法分离组织，然后使用Gentle MACS协议（Miltenyi Biotech，成人脑分离试剂盒，小鼠和大鼠）进行酶处理。让组织在试管底部沉淀，然后用吸管小心去除多余的PBS。然后用Hanks平衡盐溶液（HBSS）冲洗组织，转移到MACS M管中，再次让其沉淀在试管底部。用吸管去除多余的HBSS。接着将组织重新悬浮在含有DNAse 1（1 mg/mL）的2 mL分离液中。将组织-酶混合物在37°C的加热浴中孵育5分钟。迅速翻转M管，确保所有分离的组织都留在溶液中。然后将M管放入MACS组织分离器中，开始brain 1程序。brain 1程序结束后，将M管从MACS分离器中取出，在37°C的加热浴中孵育5分钟。再次迅速翻转M管，然后开始brain 2程序。程序结束后，向分离液中加入10 mL分离缓冲液，并用1000 μL吸管将混合物搅匀10次。然后将12 mL的匀浆液转移到15 mL试管中，在4°C下以200g的力离心5分钟。得到的细胞沉淀重新悬浮在500 μL的分离缓冲液中，通过70u细胞过滤器过滤到FACS收集管中，准备进行细胞分选。

**荧光激活细胞分选（FACS）**：
所有试管首先用2% BSA在HBSS中预封闭。使用标记细胞类别（例如GFP+）的单染色样本来设置门限。仅分选出GFP阳性的细胞，并收集到含有200 μLPBS和0.04% BSA的收集管中。分选出的单细胞悬浮液立即用于单细胞RNA测序的文库制备。

**单细胞RNA文库制备和测序**：
每个样本最多使用10,000个活细胞进行文库制备。文库的制备遵循10× Genomics Chromium Next GEM Single Cell 3? Reagent Kits v3.1协议（Chromium Single Cell V(D) J Reagent Kits，具有细胞表面蛋白的特征条形码技术，文档编号CG000186 Rev A，10× Genomics，2019年7月25日）。简而言之，使用基于液滴的封装方法将单细胞与凝胶珠结合，加入分离油和逆转录主混合物生成基因表达乳液（GEMs）。生成的GEMs被清洗、构建表达文库、条形码化，并以每个细胞20,000个读对的深度进行测序，采用配对末端双索引（详见制造商说明）。

**质量控制和数据处理**：
原始数据使用Cell ranger v. 7.0.1进行处理。使用2024-A Mouse GRCm39作为序列比对的参考基因组。Cell ranger的输出包括矩阵、特征和条形码，使用Seurat v. 4.3.0.1进行处理。质量控制指标包括通过nCount_RNA、nFeature_RNA、percent.mt和percent.rb进行过滤。使用DoubletFinder算法去除双重细胞。

**基于RNA速度的轨迹重建**：
使用Cell ranger pipelines的输出文件（包括possorted_genome_bam.bam）生成loom文件，然后使用velocyto实现。将.h5ad FA2-embedded数据集与.loom splicing矩阵连接后，使用scVelo进行RNA Velocity分析。应用动态模式生成速度方向，然后在Leiden聚类中根据速度向量的方向性将数据分为“稳态”和“激活”细胞状态。使用这两个定义的细胞状态（即稳态（Tmem119+）和激活（Apoe+）进行下游分析，以了解调控机制。

**基于RNA速度的承诺分数估计**：
为了评估两种识别的细胞状态（即稳态和激活）内的细胞承诺度，以及稳态和激活细胞群体向稳态和激活状态的过度，计算了细胞水平的RNA速度向量，数据来自整合的单细胞RNA测序数据集。通常，一个细胞的速度向量由两个分量x和y组成，分别代表2D降维ForceAtlas2嵌入中的方向和大小。
对于每个速度向量i，其大小计算为欧几里得范数：
$$
m \cdot a \cdot g \cdot n \cdot i \cdot t \cdot u \cdot e = \sqrt{v_x^2 + v_y^2}
$$
（公式1）
每个向量的方向由atan2函数计算的角度描述：
$$
\theta_i = \arctan2\left(\frac{v_y}{v_x}\right)
$$
（公式2）
然后将角度从弧度转换为度，并标准化到[0, 360]范围内：
$$
\theta_{de} = \theta_i \cdot \frac{180\pi}{m}
$$
（公式3）
为了评估方向偏差，将角度范围（0–360°）分成若干个区间（每个区间10°）。将同一角度区间内的所有速度向量的大小相加，得到每个方向的“累积大小”：
$$
b_i = \sum_{k=0}^{N} |v_k|
$$
（公式4）
$$
b_i = \sum_{k=0}^{N} \frac{i_k \cdot v_k}{|v_k|}
$$
（公式5）
$$
b_i = \sum_{k=0}^{N: b_k \leq b_i} \frac{i_k}{|v_k|}
$$
（公式6）
分别处理两个数据集（mg_tr1代表激活亚群，mg_tr2代表稳态亚群），计算它们的方向累积大小。计算累积大小的比率，以量化角度区域A和B之间的方向偏差或总体速度分布的差异。所得比率代表未标准化承诺分数（unCS）：
$$
u_{cs} = \sum_{k \in A} \frac{b_k}{|v_k|}
$$
（公式7）
$$
u_{cs} = \sum_{k \in B} \frac{b_k}{|v_k|}
$$
（公式8）
其中unCS > 1表示mg_tr1向稳态状态的承诺度。
由于细胞承诺度依赖于累积大小，而累积大小又高度依赖于细胞数量，因此需要进一步标准化。细胞数量可能受到实验条件或样本间的批量效应的影响。因此，实际承诺分数介于未标准化和标准化承诺分数之间。标准化承诺分数（nCS）根据细胞数量进行调整，公式为：
$$
n_{cs} = \frac{u_{cs}}{\frac{n_1 + n_2}{n_1 \cdot n_2}
$$
（公式9）

**组装选定的公开可用的单细胞RNA测序数据集以生成小鼠参考图谱**：
为了生成一个代表性的小鼠参考图谱，以便从不同的实验条件下高效映射髓系细胞群体，我们选择了代表小鼠健康和疾病状态的公开可用的小鼠数据集。分析中的每个批次代表一个单独的SRR。对于健康状态，我们关注了来自“发育中的小鼠视网膜”和“健康成年小鼠视网膜”的数据集。对于疾病状态，我们关注了来自两种疾病小鼠模型的数据集：“视神经压迫模型（ONC）”和“小鼠微珠青光眼模型”。选定数据集的完整列表总结在表S1中。每个数据集都独立进行了质量控制和数据处理，然后通过以下方法进行数据整合：（1）默认的Seurat整合，（2）基于Seurat RPCA的整合（发育中的视网膜），（3）Harmony（健康成年视网膜）或scVI（视神经压迫视网膜）。数据整合的方法根据批次数量、批次变异和细胞总数来确定。为了进一步分析不同条件下的髓系细胞，我们从每种条件中以及移植后的宿主髓系数据集中分离出健康的野生型髓系群体。每个数据集都被重新缩放，然后使用默认的Seurat整合算法进行整合。为了允许基于健康成年小鼠视网膜图谱进行细胞-细胞相互作用分析和宿主移植后髓系的参考映射，我们使用差异表达基因和公认的细胞类标记来识别图谱中存在的细胞类别。

**健康成年髓系轨迹重建**：
我们从健康成年小鼠视网膜图谱中采样髓系群体。考虑到涉及的批次数量和每个批次中的细胞数量变化，我们使用scVI生成了具有2个隐藏层和30个潜在空间的健康成年小鼠髓系子集嵌入。利用scFates方法进行细胞命运轨迹重建。通过重建的轨迹，我们识别出了髓系细胞的三种状态：1）小胶质细胞/巨噬细胞，2）T细胞，3）树突状细胞。这种方法允许我们更精确地将实验中的宿主移植后髓系细胞数据集映射到定义的小胶质细胞/巨噬细胞髓系群体上。在健康成年视网膜图谱中添加了髓系细胞群体的注释标签，然后使用该图谱作为宿主移植后髓系细胞数据集的方位基注释工具。

**基于计算机模拟的髓系替换和细胞-细胞相互作用分析**：
为了进行基于计算机模拟的髓系替换实验，我们使用健康成年小鼠视网膜作为“受体/宿主”进行模拟。根据出生后的周数，将整合的数据集分为三个发育时间点：年轻成年、成熟成年和老年。使用CellChat v. 2.1.0软件分析细胞间的细胞-细胞通信。管线包括一些非默认设置：trim = 0.1，raw.use = F，population.size = F，type = ‘truncatedMean’在computeCommunProb()中，使用PPI.mouse平滑数据。跳过髓系丰度低的时间点以避免假阳性。在计算机模拟中，将健康成年小鼠视网膜的髓系群体用1）移植后的宿主髓系群体或2）健康发育中的视网膜髓系群体替换。这是通过明确从一种条件中分离出感兴趣的群体，并将数据集的其余部分与另一种条件下的小胶质细胞/巨噬细胞子集合并实现的。在这两种情况下，都使用CellChat分析细胞间的细胞-细胞相互作用。然后以时间点依赖的方式探索了三组CellChat对象。以20周龄的时间点作为（6个月大的小鼠的代理，将在其中进行RGC的体内移植），比较成年小鼠视网膜中进入和离开髓系细胞的信号。然后将差异富集的基因应用于这三组CellChat对象。例如，对健康成年视网膜的三个组（年轻成年、成熟成年、老年）进行定量分析，其中1）保留了“宿主”髓系，即天然的健康成年髓系；2）髓系群体被移植后的宿主髓系群体替换；3）髓系群体被发育中的视网膜髓系群体替换。

**集成髓系群体的ssGSEA通路分析**：
使用escape v. 1.10.0对来自5种条件（发育、成年、青光眼模型、视神经压迫模型、移植后的宿主）的整合髓系群体数据集进行ssGSEA通路富集分析。我们专注于来自分子特征数据库的炎症相关通路。每个组和通路的标准化富集分数（NES）进行平均，然后以通路独立的方式从0到1进行归一化。然后将每个通路中标准化平均NES的表格可视化为多边形图。

**集成髓系群体的WGCNA分析**：
此外，还使用WGCNA v. 1.72–1和hdWGCNA v. 0.4.03包对上述5种条件下的整合髓系数据集进行了WGCNA分析。我们识别出与“移植后宿主”状态相关的特定模块，并使用得分最高的三个模块来构建枢纽基因网络图。生成的对象被保存在.rds文件中，可以根据需求提供。通过免疫组化验证选定的单细胞RNA测序目标在视网膜全切片中的表达情况，以验证从分析中识别的差异表达基因。简而言之，另一批具有相同背景、年龄和性别的小鼠被移植了供体视网膜神经节细胞（RGC），第三天后将这些小鼠处死。取出眼球后，在角膜缘处用11号手术刀穿刺眼球，并在室温下用4%的福尔马林固定15分钟。组织用PBS短暂洗涤以去除多余的固定剂，然后去除前段和晶状体。对视网膜进行切割以便平铺，之后将视网膜取出并用PBS（pH 7.4；3次，每次5分钟）洗涤，并转移到封闭液中（PBS中加入10%的驴血清、0.5%的Triton-X和1%的BSA）。在室温下封闭4小时后，将视网膜在与封闭液混合的初级抗体中孵育3天。初级抗体孵育完成后，用PBS（3次，每次15分钟）洗涤视网膜，然后在封闭液中加入次级抗体并在4°C下孵育2天。次级抗体孵育后，再进行3次PBS洗涤（每次15分钟），之后使用Prolong Diamond Antifade Mountant（ThermoFisher Scientific）将视网膜平铺并加盖。使用的初级抗体包括：Tmem119（1:500，Synaptic Systems #400 004）、Spp1/OPN（1:500，R&D Systems #AF808）和Apoe（1:500，Synaptic Systems #465 004）。次级抗体包括驴抗豚鼠405和647（Jackson Immuno Research #706–475-148和#706–605-148）以及驴抗山羊647（Invitrogen #A32849）。切片在Leica TCS SP8共聚焦显微镜上成像，并在ImageJ中优化亮度和对比度。

**小胶质细胞定量和图像分析**
通过ImageJ（美国国立卫生研究院）对来自免疫组化分析的小胶质细胞图像进行分析。基于z堆栈图像的最大投影长度测量小胶质细胞的长度（分别为28.02 μm和21.23 μm）。使用ImageJ中的“straight”工具测量细胞的长度和坐标。在细胞中心绘制一条线，穿过两端最长突起的中心，并将其描述为最大细胞范围。使用ImageJ显示所测细胞的长度（以微米为单位）和位置（XY坐标）。Tmem119和Cx3cr1被用作小胶质细胞状态分析的标记物。所有测量工作由两名研究人员在蒙蔽条件下完成，并根据DAPI的适当对比染色结果进行。为了构建3D密度图，将量化数据导入R中，转换为数值格式，过滤掉异常值，并空间剪切到ImageJ感兴趣的区域。剪切后的数据合并成一个点集。使用二维高斯核密度估计（kde2d）在800×800的网格上估计空间密度，带宽自动选择或由用户指定。为了可视化局部平均神经突长度，首先将点分组到相同的网格上计算每组的计数和总长度，然后使用与KDE带宽匹配的高斯核对两个网格进行平滑处理；平滑后的平均长度通过平滑后的总长度除以平滑后的计数值计算得出（加上一个小epsilon以避免除以零）。最后，使用Plotly生成3D表面图，以KDE生成的网格作为表面高度（密度），以平滑后的平均长度作为表面颜色。

**定量和统计分析**
在ImageJ/Fiji中使用共聚焦z堆栈的最大强度投影进行定量图像分析。小胶质细胞的最大细胞范围定义为穿过细胞体的最长直线距离，测量的是相对突起远端之间的距离。根据指定的标记组合确定细胞身份和激活状态，测量工作由两名研究人员在蒙蔽条件下独立完成。在图4L和4M中，n代表单独测量的细胞数量：Tmem119+Spp1?，n = 34；Tmem119?Spp1+，n = 78；Cx3cr1+ApoE?，n = 159；Cx3cr1+ApoE+，n = 38。统计显著性定义为p < 0.05；图4L和4M中的比较结果显示p < 2.2 × 10^-16。具体样本量和显著性值在相应的图例中提供。空间密度分析在R中进行，保留了有效的测量结果，并将观察限制在预定义的ImageJ兴趣区域内。在800×800的网格上使用二维高斯核密度估计进行计算，从平滑后的细胞计数和总长度网格中计算局部平均细胞范围。

**单细胞RNA测序数据处理**
单细胞RNA测序数据使用Cell Ranger v7.0.1和Seurat v4.3.0.1进行处理。根据库大小、检测特征、线粒体转录本和核糖体转录本的质量控制指标筛选细胞，并使用DoubletFinder排除预测的双胞胎细胞。公共数据集在整合前分别使用Seurat、reciprocal PCA、Harmony或scVI进行处理，具体取决于数据集的大小和批量结构。使用velocyto、scVelo和scFates进行RNA速度和轨迹分析；使用CellChat v2.1.0评估细胞间通信；使用escape v1.10.0进行通路富集；使用WGCNA v1.72-1和hdWGCNA v0.4.03分析共表达网络。标准化后的富集分数按条件和通路平均，并重新缩放到0到1之间以便可视化。从相关CellChat比较中排除了髓系细胞代表性不足或缺乏主要视网膜细胞类别的数据集，以减少不稳定或误导性的估计。未进行正式的样本量计算，也没有应用实验随机化或分层；但是，图像测量是在蒙蔽条件下进行的。描述性单细胞分析没有使用分布假设，在空间量化之前应用了有限值过滤。

**额外资源**
本研究中生成的“移植后宿主”单细胞RNA测序数据已存放在GEO上，参考编号为GSE285564。本研究生成的代码已上传到GitHub：https://github.com/mcrewcow/neurons_transplantation_microglia，生成的小鼠健康成年视网膜图谱可在CELLxGENE上找到：https://cellxgene.cziscience.com/collections/7dd7e8a1-f7c2-4213-9f23-dd52afb7ee16。有兴趣为未来版本的参考图谱贡献数据的研究人员应直接联系相应的作者。我们不对表S1中标记为“未发表”的原始数据集主张任何作者权。

**补充信息（1）**
PDF（3.37 MB）
文档S1：图S1–S8和表S1