中枢神经系统靶向AAV基因治疗：衣壳工程、递送路径与临床转化

《Cell Reports Medicine》：CNS targeted AAV gene therapies: Recent advances and clinical insights

腺相关病毒（AAV）载体目前是中枢神经系统（CNS）体内基因转移的主导平台。八种获FDA批准的AAV疗法（其中四种用于CNS疾病）表明，基于AAV的遗传药物能够改变毁灭性神经系统疾病的病程。与此同时，临床前和临床经验已识别出持续存在且相互依存的障碍，包括剂量依赖性毒性、脱靶转导以及～4.7 kb的包装限制；为实现更广泛的临床影响和持续成功，必须解决这些障碍。本文中，研究人员回顾AAV生物学及近期衣壳工程策略，评估给药途径和包装限制如何影响安全性与有效性，并综合来自CNS和非CNS AAV基因治疗的临床与上市后数据。研究人员得出结论：没有任何单一衣壳、递送途径或表达策略能够解决所有CNS疾病；安全有效的治疗需要在疾病个体化基础上优化衣壳、载荷和给药方案。

Introduction：中枢神经系统（CNS）疾病传统治疗多限于支持和对症；基因治疗为明确遗传病因者提供疾病修饰可能。AAV载体可转导有丝分裂后神经元并实现脑和脊髓持久表达，重组AAV（rAAV）一般非致病、主要以游离附加体持续存在于有丝分裂后细胞。但高剂量相关毒性、～4.7 kb包装限制及针对衣壳和转基因产物的免疫反应限制转化；八种FDA批准的体内AAV疗法说明平台进展，同时CNS仍面临包装容量、剂量依赖性毒性和精准转导三大相互依存障碍，需按疾病优化衣壳、载荷和给药途径。

Underlying AAV biology：AAV衣壳由VP1、VP2、VP3按约5:5:50组装为60-mer二十面体，VP1含磷脂酶A2（PLA2）结构域。血清型分类已从血清学转向系统发育分析；衣壳序列差异影响受体使用、组织嗜性和转导效率。AAV进入为多模式、血清型依赖过程，涉及细胞表面聚糖、AAV受体（AAVR；KIAA0319L）、GPR108、RNF121、TM9SF2、CD164及AAVR2/羧肽酶D（CPD）等；AAVR与内体向反面高尔基网络（TGN）运输相关，SNX3-retromer可能参与，GPR108参与VP1-PLA2介导的内体/TGN逃逸，核输入依赖importin-α/β。核内脱壳后rAAV单链DNA（ssDNA）转为双链游离附加体，衣壳依赖的组蛋白修饰可影响表达。

Advances in capsid engineering：天然AAV转导疾病相关细胞效率有限，常需高剂量；AAV9可跨血脑屏障（BBB），但临床可见肺、肝、肾严重不良事件。衣壳工程主要包括衣壳DNA shuffling、无偏肽插入选择和机制导向的有偏肽插入选择。Shuffling受cap基因约2.2 kb短读长测序限制，条形码和长读长测序改善鉴定；非人灵长类（NHP）无偏选择获得AAV-DB3（深部脑靶向、低剂量单次输注）、AAV-Ep+（室管膜和皮层神经元）及VCAP-102（经碱性磷酸酶（ALP）介导跨BBB）。有偏策略靶向转铁蛋白受体1（TfR1）获得AAV-BI-hTFR1，靶向碳酸酐酶IV获得AAV-hCA4-IV68/IV77；DARPin展示AAV仍处早期。

Limitations and pitfalls of current AAVs：现存障碍包括给药途径依赖的生物分布、种属特异性嗜性、载荷大小、表达与细胞类型特异性控制及免疫原性；这些障碍机制上相互依存，优化一项常牺牲另一项，例如系统静脉（IV）递送扩大CNS暴露但增加外周组织和剂量依赖性毒性，增加调控元件则压缩载体基因组（vg）装载治疗载荷的空间。

Routes of delivery, targeting, and safety challenges：IV最无创，但BBB转运、基底膜和血管周隙、细胞外空间通道（可窄至10–20 nm）及AAV 25–40 nm流体动力学直径限制扩散；AAV9 IV常需≥10¹⁴ vg/kg，Zolgensma标示1.1×10¹⁴ vg/kg，伴血栓性微血管病（TMA）和肝毒性风险，而较低剂量1.5–4.5×10¹³ vg/kg在GM1神经节苷脂沉积症中安全性较好。工程BBB衣壳的SYNRGY试验首例死亡后终止，死因为脑水肿，靶受体ADAM15。脑脊液（CSF）途径经鞘内（IT）、小脑延髓池（ICM）或脑室内（ICV）递送可绕过BBB、提高CNS靶向并降低外周暴露和绝对剂量；IT用于GAN和SOD1-ALS，ICM用于FTD-GRN（2.1–4.2×10¹³ vg），ICV用于Phelan-McDermid综合征。脑实质内（IP）需立体定向手术，野生型衣壳分布局限，AMT-130经6次输注给AAV5（6×10¹²–6×10¹³ vg），而AAV-DB3单次IP输注在成年NHP中实现45%–95%中型多棘神经元转导。工程衣壳有望降低剂量并改善治疗指数和可扩展性。

Species-specific AAV tropism and other barriers to translation：临床前嗜性不总能预测NHP或人。PHP.B/PHP.eB在C57BL/6J小鼠中较AAV9约100倍改善CNS靶向，但依赖不保守的LY6A而失败；小鼠选择未在猕猴产生强CNS靶向，小鼠选择在狨猴改善后仍不如食蟹猴中的AAV9；衣壳依赖表观遗传标记可造成小鼠与人细胞>100倍表达差异。受体知情策略靶向保守或人特异生物学，VCAP-102和BI-hTFR1改善灵长类及人相关系统表现。CSF递送受CSF流动力学和解剖影响，种属间CSF体积和周转非线性：人约150 mL、食蟹猴约10 mL、小鼠<50 μl；IT倾向脊髓，ICV更利于皮层和小脑分布。ICV已用于Rett综合征和Phelan-McDermid综合征等；CSF途径应视为靶点和疾病特异设计变量。

AAV packaging constraints and control of transgene expression：～4.7 kb包装限制在含强启动子、WPRE/polyA及反向末端重复（ITR）时可将编码序列空间压缩至约2.4 kb；微启动子及截短/优化3′元件可恢复数百碱基，单细胞染色质可及性筛选获得的细胞类型特异增强子可替代大启动子。约30%人蛋白编码序列超AAV容量，约6%大于4 kb；CNS长转录本常与神经元功能和脑发育相关。SpCas9约4.1 kb，紧凑SaCas9和Nme2Cas9约3.2 kb，EDIT-101以单个AAV5递送SaCas9和两个guide RNA（gRNA）。大载荷可用分裂载体和分裂内含肽蛋白反式剪接，视网膜ABCA4（6.8 kb）已有试验；脑和脊髓需同一细胞共转导，概率随单载体转导率平方缩放，野生型AAV9 IV在NHP主要靶向胶质且神经元稀疏；AAV-DB3在NHP纹状体约94%中型多棘神经元靶向，但共转导待验证。小鼠高剂量AAV.PHP.eB（2×10¹⁴ vg/kg）分裂内含肽碱基编辑可达59%批量等位基因编辑；degron标记内含肽可减少残留内含肽免疫原性。核酸酶产生双链断裂和插入/缺失风险；碱基编辑器和先导编辑器用切口酶避免双链断裂，但仍受包装限制。

AAV immunogenicity：免疫反应包括预存衣壳免疫降低疗效或排除治疗，以及剂量依赖性免疫毒性；初始给药后针对衣壳和转基因产物的免疫反应可影响持久性并限制再给药；相关免疫学策略超出本综述范围。

Clinical insights：已批准CNS AAV疗法、非CNS疗法经验和上市后监测共同提供临床启示。

Approved AAV gene therapies for CNS disorders：已批准CNS AAV疗法涵盖IP、CSF和IV。Luxturna以AAV2视网膜下注射1.5×10¹¹ vg/眼治疗RPE65相关视网膜营养不良，8–9年随访视力和光敏感改善维持，但脉络膜视网膜萎缩见于13%–50%治疗眼。Kebilidi经双侧壳核4次输注、单次立体定向手术给予1.8×10¹¹ vg治疗AADC缺乏症，主要并发症为操作相关，短暂运动障碍见于77%并约3个月缓解。Zolgensma以AAV9 IV 1.1×10¹⁴ vg/kg治疗SMA，15 kg患者总剂量1.65×10¹⁵ vg，标签含严重肝损伤/急性肝衰竭盒装警告，2024年增加AAV载体整合和潜在致瘤风险警告；两例CNS肿瘤未显示载体直接归因，长期获益风险仍有利。Itvisma 2025年获批，IT固定剂量1.2×10¹⁴ vg，15–17 kg患者较Zolgensma低13–15倍，STEER和STRENGTH研究运动改善与Zolgensma相当；肝毒性11%，可能因AAV9自CNS逃逸，7.4%不良事件符合背根神经节（DRG）毒性监测，早期数据支持局部递送降低外周毒性。

Lessons from non-CNS AAV therapies：2020–2025年至少11例治疗相关死亡见于系统剂量≥1×10¹⁴ vg/kg的肌肉靶向AAV项目。ASPIRO中XLMTM 4例死于非免疫介导胆汁淤积性肝衰竭，后续发现半数以上患者有未识别肝胆疾病。Elevidys或SRP-9004（AAVrh74）在非卧床肌营养不良患者中3例急性肝衰竭死亡，提示晚期神经肌肉病可能易感高剂量AAV肝毒性且标准肝筛查可能漏诊。PF-06939926约15%患者出现补体介导TMA，抗衣壳抗体经经典途径激活补体。Roctavian治疗血友病A中FVIII表达5年显著下降，部分恢复因子预防，反映有丝分裂细胞中游离附加体稀释；CNS有丝分裂后神经元受影响较小，Zolgensma随访10年表达持续，但小胶质细胞年更新约28%，胶质表达疗法仍可能面临持久性挑战。系统AAV≥～1×10¹⁴ vg/kg具肝毒和补体风险，CNS宜采用IT、ICM、IP等低肝暴露途径。

Post-marketing surveillance and safety indications：批准后监测如FDA不良事件监测系统（AEMS；原FAERS）提供长期真实世界安全信号，但存在漏报、重复/不完整报告和不能确立因果等局限；FDA指南强调长期随访。Zolgensma 2019年获批、全球治疗>5000例；截至2026年3月AEMS报告2,134例（1,324例严重），常见发热、呕吐、AST/ALT升高、肝酶升高和血小板减少，多发生于输注后1个月内尤其8天内；严重信号包括143例死亡、666例住院、86例危及生命及TMA和心肌损伤（肌钙蛋白升高）。体重≥8.5 kg者血小板减少和TMA报告比值比分别为1.45和2.4，属相对报告频率而非发生率；102例管理访问队列安全性与试验一致，年龄影响解释，绝对剂量与补体血管损伤关系未明。标签已警告肝毒性、TMA、肌钙蛋白I升高和理论致瘤风险。Luxturna 2017年获批，AEMS报告150例（37例严重），常见眼部事件包括视网膜变性、眼压升高、眼痛、视力损害、白内障、视网膜裂孔、视网膜色素脱失及出血/炎症；脉络膜视网膜萎缩未在试验中识别，2022年加入标签，PERCEIVE登记4年29.6%、5年36.5%，但萎缩眼光敏感并不更差；严重结局少，1例死亡、14例住院、无危及生命。局部递送使长期安全负担转向操作和组织特异损伤；监测应按给药途径和疾病生物学组织，IV主要系统脱靶，局部眼转向靶组织和操作并发症；需统一登记、标准病例定义和途径感知长期随访，IT/IP尚缺充分上市后数据。

The future of AAV therapies for CNS disorders：已批准CNS AAV疗法均使用野生型衣壳、靶向不精确且剂量接近临床定义的毒性阈值，均未解决包装限制和真正细胞类型特异性；但对SMA婴儿、RPE65视网膜营养不良儿童和AADC缺乏症患者仍产生有意义的临床获益，因小转基因、可及靶组织和足够疾病严重度可接受风险。下一代需面对Huntington病、Rett综合征、SYNGAP1相关障碍、STXBP1相关障碍和Angelman综合征等需广泛分布脑区转导及紧密表达控制的疾病，过表达剂量敏感转基因可能有害；许多基因超～4.7 kb，分裂载体在视网膜有前景但NHP或人脑尚未证实。无单一衣壳、给药途径或表达策略可解决全部问题，需按疾病定制衣壳、载荷、调控元件和递送途径。工程衣壳AAV-DB3、VCAP-102和BI-hTFR1在NHP较AAV9改善20–400倍，可能使有效剂量低于～1×10¹⁴ vg/kg毒性范围，但PHP.eB前车之鉴及首个IV BBB工程衣壳试验脑水肿死亡提示更强衣壳可能带来新风险。第一代疗法已提供剂量阈值、途径特异毒性、持久性时间线和监测间隔，下一代应据此设计；挑战已从AAV能否在CNS发挥作用转为如何实现安全、精准和疾病特异工程化。