秘鲁碳青霉烯酶产生大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌的威胁扩展：高风险克隆传播的表型与基因组学证据

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Expanding threat of carbapenemase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Peru: genomic and phenotypic evidence of high-risk clones dissemination

　　

摘要专业翻译 碳青霉烯酶产生肠杆菌目细菌（Carbapenemase-producing Enterobacterales, CPE）因其广泛的抗菌药物耐药性和快速传播能力，构成了日益严峻的全球性威胁。本研究对2020年至2022年间从秘鲁利马四家医疗机构收集的大肠埃希菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）分离株进行了表型与基因组学特征分析。研究人员共分析了320株非重复分离株（61株大肠埃希菌和259株肺炎克雷伯菌），通过抗菌药物敏感性试验、聚合酶链反应（PCR）和全基因组测序（WGS）进行研究。最常见的碳青霉烯酶基因为blaNDM（69%），其次为blaKPC（16.9%）和blaOXA-48-like（4.6%）。11株肺炎克雷伯菌同时产NDM和KPC，1株大肠埃希菌同时携带NDM和OXA-48-like。所有分离株均为多重耐药菌，5%对常规检测面板中所有药物耐药；然而，氨曲南/阿维巴坦（aztreonam/avibactam）和头孢地尔（cefiderocol）对所测分离株保持了完全的体外活性。新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合如氨曲南/阿维巴坦和头孢地尔对所有类别的碳青霉烯酶均表现出完全活性。基因组分析揭示了大肠埃希菌主要序列型（ST）为ST167和ST410，肺炎克雷伯菌谱系为ST147、ST15、ST45和ST273。blaNDM-5等位基因在秘鲁首次被检出，主要见于大肠埃希菌ST167，且携带于多复制子IncF型质粒上。在肺炎克雷伯菌中，ST147被鉴定为与blaNDM-1相关的优势克隆，表明高风险克隆群的持续性本地传播。多种碳青霉烯酶与质粒骨架的共存凸显了耐药机制的持续演化。本研究提供了秘鲁碳青霉烯酶产生大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的首个整合性基因组学概述，并强调了持续开展基因组学监测和抗菌药物管理以减轻其临床和流行病学影响的必要性。

论文解读

一、研究背景与研究意义

碳青霉烯酶产生肠杆菌目细菌（CPE）的流行与传播已成为全球重大公共卫生威胁，因其治疗选择极为有限，常需使用高成本抗菌药物。世界卫生组织（WHO）已将CPE列为最高优先级病原体，强调迫切需要监测其出现并实施缓解策略。碳青霉烯酶在碳青霉烯耐药中发挥核心作用，是肠杆菌目细菌碳青霉烯耐药的主要机制。这些酶按Ambler分类分为A、B、D三类，其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）、新德里金属-β-内酰胺酶（NDM）和OXA-48-like变体是全球流行最广的类型。拉丁美洲已出现碳青霉烯酶产生菌的地方性传播，巴西、哥伦比亚、阿根廷和墨西哥等国的相关文献数量最多。在秘鲁，A、B、D类碳青霉烯酶均有报道，但NDM仍是最常报道的类型。尽管秘鲁此前已有碳青霉烯酶的报道，但纵向多中心基因组学数据仍然匮乏。本研究通过整合表型药敏试验、全基因组测序（WGS）、质粒背景分析和克隆群体结构分析，填补了这一空白，覆盖利马四家医疗机构。该研究提供了秘鲁碳青霉烯酶产生大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的首个多中心基因组学特征描述，也是秘鲁国内bla_NDM-5的首次报道，具有重要的流行病学意义。

二、研究设计与技术方法

研究人员于2020年至2023年间，从秘鲁利马四家医疗机构（包括EsSalud系统的三级国家转诊中心Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen、卫生部（MINSA）三级教学医院Hospital Nacional Hipólito Unanue、MINSA二级急诊专科医院Hospital de Emergencias Ate Vitarte，以及秘鲁最大的私立诊断实验室网络之一Laboratorio Clínico Roe）收集了61株大肠埃希菌和259株肺炎克雷伯菌非重复疑似CPE分离株，样本来源于住院和门诊患者的尿液和血液标本。所有分离株随后送至皮乌拉大学（UDEP）进行表型和基因组学特征分析。主要技术方法包括：Blue-Carba试验进行碳青霉烯酶表型筛查，EDTA、苯硼酸和阿维巴坦抑制试验区分Ambler酶类；纸片扩散法进行药敏试验并按CLSI M100标准判读，COL-spot试验评估多黏菌素敏感性；PCR扩增鉴定碳青霉烯酶基因；对83株具有重要流行病学或微生物学意义的分离株进行Illumina NextSeq平台短读长测序，其中8株额外进行MinION平台长读长测序；生物信息学分析包括FastQC质量评估、Trimmomatic修剪、Unicycler组装、QUAST质量评价、Prokka注释，以及MLSTFinder、ResFinder、PlasmidFinder、pMLSTFinder、Kleborate、VirulenceFinder、ClermonTyping、SeroTypeFinder、Kaptive、PHASTER等工具进行序列分型、耐药基因、质粒复制子、毒力因子、血清型和前噬菌体鉴定；SNP-sites提取单核苷酸多态性位点后以IQ-TREE构建最大似然系统发育树，并通过Microreact可视化；同时从EnteroBase和Pathogenwatch获取南美洲代表性基因组进行区域比较系统发育分析。

三、研究结果

表型筛查与抗菌药物敏感性谱

表型筛查鉴定出222株金属-β-内酰胺酶（MBL）产生菌（大肠埃希菌41株，肺炎克雷伯菌181株）、54株A类丝氨酸碳青霉烯酶产生菌（大肠埃希菌1株，肺炎克雷伯菌53株）和33株D类丝氨酸碳青霉烯酶产生菌（大肠埃希菌19株，肺炎克雷伯菌14株）。12株菌在表型试验中同时呈丝氨酸和金属碳青霉烯酶活性阳性。大肠埃希菌对环丙沙星（100%）、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（83.6%）、阿米卡星（75.4%）和头孢他啶/阿维巴坦（67.2%）耐药率较高，对磷霉素（6.5%）和多黏菌素（8.2%）耐药率较低。肺炎克雷伯菌对头孢菌素类、单环β-内酰胺类和氟喹诺酮类几乎全部耐药，对甲氧苄啶/磺胺甲噁唑（81.9%）、庆大霉素（89.2%）、阿米卡星（65.6%）和头孢他啶/阿维巴坦（74.1%）耐药率较高，对磷霉素（14.7%）和多黏菌素（29.3%）耐药率较低。17株菌对所有常规检测药物耐药，但氨曲南/阿维巴坦和头孢地尔保持完全体外活性。101株菌被归类为广泛耐药（XDR），其余CPE按国际标准归类为多重耐药（MDR）。

选定β-内酰胺类药物的最低抑菌浓度

对100株选定分离株的最低抑菌浓度（MIC）检测显示，所有分离株对氨曲南/阿维巴坦和头孢地尔均敏感，未检测到耐药。相比之下，40%的分离株对头孢他啶/阿维巴坦耐药，该结果与bla_NDM基因的存在相关。

碳青霉烯耐药遗传标志物

PCR检测显示69.0%的分离株携带bla_NDM（40株大肠埃希菌和181株肺炎克雷伯菌），16.9%携带bla_KPC（1株大肠埃希菌和53株肺炎克雷伯菌），4.6%携带bla_OXA-48-like（19株大肠埃希菌和14株肺炎克雷伯菌）。11株肺炎克雷伯菌同时携带bla_NDM和bla_KPC基因，1株大肠埃希菌同时携带bla_NDM和bla_OXA-48-like。

全基因组测序分析

23株大肠埃希菌平均携带12个抗菌药物耐药（AMR）基因，bla_OXA-1、aac(6′)-lb-cr、sul-1、sul-2和catB3存在于超过78%的分离株中。检出bla_NDM-5（43.5%）和bla_NDM-1（39.1%）两种NDM等位变异体，以及bla_OXA-48（17.3%）。60株肺炎克雷伯菌平均携带13个AMR基因，bla_OXA-1（95%）、aac(6′)-lb-cr（93.3%）和sul-1（93.3%）几乎存在于所有分离株中。bla_NDM-1（88.3%）检出率最高，bla_KPC-2（25%）和bla_OXA-181（1.6%）亦有检出，9株（15%）同时携带bla_NDM-1和bla_KPC-2基因。

细菌群体结构与特定碳青霉烯酶等位基因的关联

WGS揭示碳青霉烯酶产生大肠埃希菌以ST167（47.8%）和ST410（30.4%）两个高风险谱系为主。ST167与bla_NDM（尤其是bla_NDM-5）密切相关，ST410主要与bla_OXA-48相关。系统发育分析显示优势谱系内分离株遗传关系密切，ST167两两距离6–21个SNP，ST410为2–3个SNP，支持近期克隆传播。肺炎克雷伯菌群体结构以克隆群147（CG147）为主（ST147和ST273共19株），全部携带bla_NDM。CG15（ST15/ST709，10株）专一关联bla_NDM-1，CG45（ST45，7株）主要与bla_NDM-1和bla_KPC-2共产相关（6/7株）。系统发育分析显示主要谱系内存在近期克隆扩张的证据。

与公开南美基因组的系统发育关系

核心基因组系统发育分析显示，秘鲁分离株与多个南美国家的基因组相互交错分布，而非形成国家特异性谱系。大肠埃希菌ST167秘鲁分离株与少数已报道秘鲁基因组聚集在密切相关亚谱系中，而巴西、哥伦比亚、厄瓜多尔、智利、阿根廷和巴拉圭的基因组分布在系统发育树的多个分支上。ST410形成紧凑的系统发育亚簇，嵌入包含巴西、哥伦比亚、厄瓜多尔、阿根廷、智利和乌拉圭基因组的更广泛南美群体中。肺炎克雷伯菌ST15大多与公开秘鲁基因组聚集在密切相关亚谱系中，ST45形成与巴西和哥伦比亚基因组密切聚类的独特系统发育亚簇，CG147则分布于更广泛的南美谱系中，无地理限制聚类证据。

复制子分型

质粒分析显示大肠埃希菌以IncF家族复制子为主，IncFII、IncFIA和IncFIB检出率为87%。95.6%的分离株呈多复制子状态（≥3个不相容群）。优势ST167谱系主要与携带bla_NDM-5的IncFIA/IncFIB/IncFII质粒相关，携带bla_NDM-1的ST410主要与IncC2质粒相关。值得注意的是，ST410中bla_OXA-48定位于染色体而非质粒。肺炎克雷伯菌中IncFIB/HI1B和IncFIB(K)为主要复制子（各75%），90%的分离株呈多复制子状态。CG147和CG15主要与携带bla_NDM-1的IncFIB/HI1B质粒相关，CG45共产NDM-1和KPC-2的菌株主要与IncFIB/HI1B和IncU/IncX3复制子相关。

大肠埃希菌血清型和系统发育群

ST167主要与O101:H10血清型和A系统发育群相关，所有ST410属于O8:H21和C系统发育群，两株ST131呈现全球传播的O25:H4-fimH30特征并属于B2系统发育群。

肺炎克雷伯菌K和O位点

共鉴定出21个K位点和8个O位点，产生32种K/O组合。主要荚膜类型包括KL64（21.6%）、KL74（11.6%）、KL62（11.6%）和KL48（10%）。最常见的组合为与ST147和ST15相关的KL64+O1/O2v1，以及与ST45相关的KL62+O1/O2v1。

毒力因子

所有大肠埃希菌均检出毒力相关基因，平均每基因组17个。ST131谱系毒力基因负担最高（超过30个）。铁获取系统（包括aerobactin和铁载体相关基因）主要见于ST131和ST410。肺炎克雷伯菌中45%的分离株检出毒力决定簇，最常见的毒力因子为yersiniabactin基因簇（85.2%），主要与ST45和ST15相关。1株ST23分离株携带高毒力标志物（yersiniabactin、colibactin、aerobactin、salmochelin和rmpA/rmpA2），是本菌株库中毒力基因最丰富的基因组。

碳青霉烯酶基因的遗传背景

杂交组装实现了代表性碳青霉烯酶携带质粒和染色体插入事件的完整重建。bla_NDM-1在两种不同质粒骨架中被鉴定：IncFIB/HI1B杂合质粒pKp319ndm（约359.7 kb）和IncC2质粒pEc306ndm（约203.2 kb），两者均嵌入保守的ΔISAbα125-bla_NDM-1-ble_MBL-trpF-dsbC-dct-groES结构。bla_NDM-5定位于多复制子IncFIA/IncFIB/IncFII质粒pEc231ndm（约140.3 kb），嵌入保守的ΔISAbα125-bla_NDM-1-ble_MBL-trpF-dsbC平台，并与含mphA、bla_CTX-M-15、catB3、bla_OXA-1和aac(6′)-Ib-cr的IS26富集多重耐药区相关。bla_KPC-2定位于IncX3/IncU杂合质粒pKp319kpc（约46.6 kb）内的非Tn4401元件（NTEKPC-Ic）中。bla_OXA-48在EC347分离株中为染色体整合，两侧为两个IS1R拷贝，位于铜耐药操纵子（copABCDRS）上游和镍转运系统（NikABCDE）下游。

四、讨论与结论

本研究表明秘鲁利马碳青霉烯酶产生大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的传播由高风险谱系的克隆扩张和碳青霉烯酶携带移动遗传元件的水平传播共同驱动，与拉丁美洲和全球CPE的流行模式一致。从治疗角度看，分离株对多种临床常用抗菌药物类别广泛耐药，氟喹诺酮类、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、氨基糖苷类和头孢他啶/阿维巴坦的高耐药率强化了在CPE高流行环境中这些药物经验性治疗价值有限的观点。然而，氨曲南/阿维巴坦和头孢地尔对所有测试分离株保持完全体外活性，包括产金属-β-内酰胺酶菌株和同时携带多种碳青霉烯酶的菌株，支持其在NDM型酶占主导的地区作为治疗选择的潜在价值。基因组数据显示大肠埃希菌传播集中于ST167和ST410高风险谱系，肺炎克雷伯菌以CG147（ST147/ST273）、ST15和ST45为主。区域比较系统发育分析表明秘鲁主要流行谱系是更广泛南美传播网络的一部分。质粒复制子分析支持水平基因转移在碳青霉烯酶基因传播中的作用，多复制子质粒平台的频繁检出提示复杂质粒背景可能促进碳青霉烯酶基因在临床环境中的持久性和传播。遗传背景分析显示碳青霉烯酶传播涉及多种保守移动遗传平台而非单一优势质粒骨架。bla_NDM-5在秘鲁的首次检出扩展了本地流行的NDM等位基因多样性，具有重要流行病学意义。同时产多种碳青霉烯酶的菌株（尤其是同时携带bla_NDM-1和bla_KPC-2的肺炎克雷伯菌）的出现进一步限制了治疗选择，提示感染控制措施和分子监测应特别关注携带多种碳青霉烯酶基因的菌株。ST23高毒力分离株的检出支持基因组监测计划不仅应监测耐药决定簇，还应监测毒力相关位点。研究存在一定局限性：分离株仅来自利马四家医疗机构，可能无法完全代表秘鲁全国CPE流行病学；WGS仅对选定菌株进行，可能存在选择偏倚；长读长测序仅覆盖部分菌株，限制了全数据集质粒结构和染色体插入的完全解析；比较基因组分析的解释依赖于公共数据库中基因组的可用性和代表性。研究结论指出，秘鲁利马碳青霉烯酶产生大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌呈多克隆传播，由高风险谱系和多样化移动遗传平台驱动。NDM产生菌的优势地位、bla_NDM-5的出现、大肠埃希菌ST167/ST410和肺炎克雷伯菌CG147/ST147-ST273的流行以及多碳青霉烯酶产生菌的检出，凸显了该地区碳青霉烯耐药的动态演化。所有分离株无论碳青霉烯酶类别如何均对氨曲南-阿维巴坦和头孢地尔保持敏感，支持其作为NDM产生肠杆菌目细菌占主导地区治疗选择的潜在作用。秘鲁分离株与其他南美国家基因组的密切系统发育关系进一步强调了开展协调的区域基因组监测以追踪高风险克隆和移动耐药平台跨国传播的必要性。