多价CPS-CRM197结合疫苗对小鼠重症/致死性肺炎克雷伯菌感染的保护作用

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：A multivalent CPS-CRM197 conjugate vaccine protects against severe/fatal Klebsiella pneumoniae disease in a mouse infection model

　　

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是人类感染的重要原因，且常对多种抗生素耐药。多数感染发生于存在共病和/或感染危险因素的个体。尽管已取得进展，仍需要新的治疗与预防措施。为此，研究人员建立了重症/致死性肺炎克雷伯菌感染的小鼠模型（腹腔内接种导致菌血症），以评估菌株毒力并检测多价荚膜多糖（capsular polysaccharide, CPS）结合疫苗所赋予的保护。研究人员首先比较了四株代表全球重要肺炎克雷伯菌克隆的临床分离株（ST23/KL1、ST86/KL2、ST11/KL64和ST147/KL64）的毒力，每株均携带毒力质粒（pVir）。ST11和ST147分离株还多重耐药（multidrug resistant, MDR），包括对碳青霉烯类抗生素耐药。与ST23和ST86分离株相比，ST11和ST147分离株在小鼠感染模型中毒力较低。此外，从血液中回收的存活ST11和ST147菌数随时间下降，而ST23和ST86菌数增加。为评估CPS-CRM₁₉₇结合疫苗抵御致死性感染的能力，研究人员用8种选定CPS结合物组成的鸡尾酒免疫CD-1远交系小鼠，加强两次，随后以两种毒力最强分离株之一（ST23/KL1或ST86/KL2）经腹腔接种攻击。接受CPS-CRM₁₉₇结合疫苗的小鼠受到保护，免受KL1和KL2分离株所致致死性感染，而所有假免疫小鼠均在96 h内发生致死性疾病。这些结果强调了标准CPS结合疫苗策略用于开发多价肺炎克雷伯菌疫苗的潜力。

研究背景方面，肺炎克雷伯菌是医院感染的重要病原体，常为健康宿主肠道共生菌，但在易感个体中可机会性致病，引起尿路、下呼吸道感染、腹膜炎、脓毒症等；其感染高发与抗生素耐药叠加，使治疗面临困难。社区中亦存在貌似无危险因素的感染，多与高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent K. pneumoniae, hvKP）相关，历史上多为K1或K2株（常为ST23或ST86），且多不耐碳青霉烯类；这类菌常携带编码铁载体及黏液表型调节因子的毒力质粒（pVir）。近年出现pVir与多重耐药（MDR）融合的克隆，如Gu等报道的pVir-CRKP ST11克隆及Martin等报道的pVir-CRKP ST147暴发，提示需要针对多谱系的疫苗策略。CPS是肺炎克雷伯菌丰富表面分子，可屏蔽宿主免疫，是疫苗候选靶点；既往多价CPS疫苗及CPS特异性静脉免疫球蛋白（IVIG）曾进入人体试验，但使用人用许可载体蛋白CRM₁₉₇的多价CPS结合疫苗尚未在动物感染模型中验证。研究人员此前发现8种CPS-CRM₁₉₇兔抗血清可识别并促进杀菌，但多价CPS-CRM₁₉₇鸡尾酒能否在体内保护尚未测试。因此，研究人员建立小鼠腹腔接种致菌血症的重症/致死感染模型，比较4株临床分离株毒力，并测试8价CPS-CRM₁₉₇结合疫苗的保护作用。研究得出，疫苗对KL1/ST23和KL2/ST86致死攻击提供保护，假免疫小鼠迅速死亡；这支持标准CPS结合策略开发多价肺炎克雷伯菌疫苗的潜力。

关键技术方法（约240字）：研究人员使用此前表征的肺炎克雷伯菌临床分离株（ST23/KL1、ST86/KL2、ST11/KL64、ST147/KL64等）和购自Charles River的CD-1远交系小鼠。建立腹腔内（intraperitoneal, IP）接种的腹膜炎/脓毒症模型，先以不同菌落形成单位（colony-forming unit, CFU）确定各株接种量，监测生存与体重，终点采血测菌血症，并取组织行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）病理评分。疫苗为8种CPS-CRM₁₉₇结合物加Alhydrogel皮下免疫三次，末次后2周以ST23/KL1或ST86/KL2攻击，设假免疫对照。流式细胞术测血清鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）结合，采用log-rank Mantel-Cox检验及Holm-Sidak校正。

研究结果如下。其一，“在CD-1小鼠中评估肺炎克雷伯菌接种量”：通过先导实验以6只/组（3雌3雄）IP接种10²–10⁷ CFU并监测10天，发现pVir-CRKP株需较pVir-KP株高约10–500倍接种量才致病；ST11株10⁷ CFU快速致重症而10⁶ CFU中度后恢复，ST147株10⁷ CFU中度且全部恢复；ST23株10²–10⁵ CFU生存呈剂量依赖，ST86株≥10² CFU均在96 h内达终点；雌雄无显著差异，后续选用雌鼠并确定各株接种量。其二，“pVir-KP或pVir-CRKP所致小鼠菌血症”：以10只/组按选定剂量感染，所有动物12 h内出现病征；ST11株9/10快速恢复，ST23、ST86和ST147株均>50%在96 h内重症；ST147株7/10约1天达终点、3只第1天后恢复，作者提出高菌量所致急性宿主反应可能参与。血中CFU显示pVir-KP株增加（56575由10²升至>10⁶ CFU/mL），pVir-CRKP株下降，ST11株仅1/10血中回收，与生存实验结果总体相符。其三，“组织病理学变化和细菌负荷”：第三次感染实验于终点或72 h采样，感染鼠胸腺、脾和肝有明显病理；ST11株组织病理有限且生存较高；心、肝、肺病变炎症总体轻微，肠系膜炎症伴大量细菌，可能与IP感染途径有关。其四，“由CPS-CRM₁₉₇结合物组成的多价疫苗保护小鼠免于重症肺炎克雷伯菌感染”：研究人员将8株临床分离株CPS分别结合CRM₁₉₇，加Alhydrogel三次免疫，55天后以KL1/ST23或KL2/ST86攻击；假免疫鼠均在80 h内重症并安乐死，疫苗组基本避免体重下降和重症，获得100%保护；疫苗鼠血清IgG滴度约16,000–32,000，与保护相关；抗血清还识别额外KL1/ST23株及KL2的ST86、ST65、ST39株（其中一株缺pVir），但未结合KL64、KL51、KL106和KL107（包括部分疫苗抗原），与既往兔抗血清结果不同，可能与佐剂或动物种属差异有关，相关研究仍在进行。

讨论部分总结：CPS丰富且可屏蔽宿主免疫，是疫苗靶点；虽然KL型别>150种，但少数ST/KL主导全球感染。CPS单独弱激活T细胞，需结合载体蛋白；CRM₁₉₇已用于成功上市的肺炎链球菌、b型流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌糖结合疫苗。肺炎克雷伯菌尚无FDA许可疫苗，多个候选处于开发或临床试验；Wantuch等报道多价O抗原或CPS生物结合疫苗可保护小鼠，Alaimo等报道四价O抗原生物结合疫苗在人体具免疫原性且局部反应有限。本模型中pVir-KP与pVir-CRKP毒力差异与宿主固有免疫、补体和中性粒细胞杀伤有关；既往显示人中性粒细胞对pVir-KP吞噬杀伤少，对pVir-CRKP易吞噬杀伤，加入CPS特异性抗体可增加pVir-KP吞噬，与本疫苗保护一致。疫苗对KL1和KL2分离株提供100%保护，并诱导针对部分非疫苗KL1/KL2株的IgG，但未检测到针对其他CPS抗原的鼠IgG；与兔抗血清差异可能源于Freund佐剂与Alhydrogel或动物种属差异，Seeberger等亦发现铝佐剂诱发的鼠IgG很低。CPS流行具地理差异，CPS-CRM₁₉₇平台可按流行和临床相关性添加或替换CPS。研究结论可译为：“这些结果强调了标准CPS结合疫苗策略用于开发多价肺炎克雷伯菌疫苗的潜力。”讨论结尾结论可译为：“尽管仍需更多工作来表征和优化多价CPS-CRM₁₉₇糖结合疫苗的免疫应答（包括使用特定佐剂），本研究为推进肺炎克雷伯菌结合疫苗策略提供了重要信息。”