《Applied and Environmental Microbiology》：Wildlife-associated ecosystems in Algeria harbor internationally distributed ESBL-producing clones and plasmids, including a CTX-M-15 Klebsiella pneumoniae ST17 lineage associated with a conserved IncFIB(K) resistance plasmid
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超广谱头孢菌素耐药肠杆菌目细菌（ESC-R-E）已播散至临床环境之外，但其在野生动物中的出现情况及基因组流行病学特征仍知之甚少，尤其是在低收入和中等收入国家。ESC耐药可源于超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）或AmpC型头孢菌素酶的产生。研究人员调查了阿尔及利亚
超广谱头孢菌素耐药肠杆菌目细菌（ESC-R-E）已播散至临床环境之外，但其在野生动物中的出现情况及基因组流行病学特征仍知之甚少，尤其是在低收入和中等收入国家。ESC耐药可源于超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）或AmpC型头孢菌素酶的产生。研究人员调查了阿尔及利亚自由放养野生动物、圈养野生动物及动物园工作人员中ESC-R-E的流行率、耐药机制及种群结构。2021年10月至2023年6月期间，研究者在阿尔及利亚六个省份共采集1,899份粪便样本。通过选择性培养回收ESC-R-E菌株，并经抗菌药物敏感性试验及全基因组测序进行表征。总体而言，共鉴定出73株（3.9%）ESC-R-E菌株，其中包括7株（0.4%）同时产OXA-48样碳青霉烯酶的菌株。圈养动物中的携带率（13.5%）显著高于自由放养野生动物（1.6%）或动物园工作人员（7.7%）。在分析的66株产ESBL菌株中，CTX-M酶占主导地位（n=61），尤其是CTX-M-15（n=53）。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）为优势菌种（n=33），其中ST17占27/33。从圈养动物、自由放养野生动物及一名动物园工作人员中回收的产CTX-M-15 ST17菌株彼此亲缘关系密切，并携带一种IncFIB(K)质粒，该质粒在多药耐药区域内含有blaCTX-M-15，与全球传播的质粒高度相关。研究还检出全球传播的高风险大肠埃希菌（Escherichia coli）克隆，即ST167、ST361、ST410，以及一个自2016年以来持续存在于阿尔及利亚野生动物中的ST38谱系。这些发现证明高风险肠杆菌目细菌谱系及可移动耐药质粒正在阿尔及利亚野生动物相关生态系统中传播，并强调有必要在人类-动物-环境交界面上实施整合性One Health抗菌药物耐药监测。
野生动物日益被认为是抗菌药物耐药性（AMR）的潜在储存库和哨兵，然而来自低收入和中等收入国家的基因组数据仍然匮乏。本研究提供了北非野生动物中超广谱头孢菌素耐药肠杆菌目细菌规模最大的基因组学调查之一。研究人员证明，国际传播的高风险肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌谱系，连同全球分布的携带CTX-M-15质粒，正在圈养动物、自由放养野生动物及动物园环境中的人类之间传播。从不同宿主物种中回收亲缘关系密切的肺炎克雷伯菌ST17菌株，突显了抗菌药物耐药性在人类-动物-环境界面上传播的潜力。这些发现将临床上重要耐药肠杆菌目细菌已知的生态范围扩展至医疗机构之外，并将野生动物相关生态系统确定为更广泛抗菌药物耐药网络的一部分。本研究强调了将野生动物纳入One Health监测计划以更好地理解和减缓环境中抗菌药物耐药性传播的价值。
一、研究背景与科学问题
抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）已成为全球公共卫生的重大威胁。肠杆菌目细菌（Enterobacterales）中的大肠埃希菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和肠杆菌属（Enterobacter spp.）对超广谱头孢菌素（expanded-spectrum cephalosporin, ESC）的耐药性，主要由超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases, ESBLs）和质粒介导的AmpC β-内酰胺酶（plasmid-mediated AmpC β-lactamases, pAmpC）驱动，这些耐药基因常位于可移动遗传元件上，便于水平基因转移和多药耐药（multidrug resistance, MDR）的播散。在One Health框架下，人类、家养动物、野生动物和环境之间的多重相互作用塑造了产ESBL和pAmpC肠杆菌的流行病学。抗菌药物在人和兽医领域的使用可选择出耐药菌，并经由直接接触、食物链、水体和环境污染扩散。因此，ESC耐药肠杆菌不仅见于临床环境，也广泛存在于牲畜、伴侣动物、食品和自然生态系统中。野生动物作为自然与人类影响环境的界面占据者，可能获得、维持并在生态系统中传播耐药菌；动物园则是外来动物、人类与环境相互作用的另一重要界面。然而，在北非地区，针对野生动物中ESC耐药肠杆菌的基因组监测仍十分有限。在阿尔及利亚，虽有研究报道候鸟携带bla
NDM-5和mcr-1等临床重要耐药基因、野猪携带产碳青霉烯酶肠杆菌，但野生动物中产ESBL和pAmpC肠杆菌的发生率、种群结构及播散机制在很大程度上尚未被探索。为此，研究人员结合大规模采样与全基因组测序，系统调查了阿尔及利亚自由放养和圈养野生动物中ESC耐药肠杆菌的流行率、基因组多样性、耐药机制和种群结构，并评估流行克隆和耐药质粒的分布，以期阐明野生动物在One Health背景下ESC耐药环境传播中的作用。
二、研究方法概述
研究人员于2021年10月至2023年6月在阿尔及利亚六个省份开展横断面调查，共采集1,899份样本，包括自由放养野生动物粪便（n=1,521）、六个动物园圈养动物粪便及环境样本（n=365）和动物园工作人员直肠拭子（n=13）。样本经含头孢噻肟（8 μg/mL）和万古霉素（32 μg/mL）的胰蛋白酶大豆肉汤富集后，接种至含头孢噻肟的MacConkey琼脂进行选择性培养；单菌落经MALDI-TOF质谱鉴定。抗菌药物敏感性试验采用纸片扩散法和肉汤微量稀释法，涵盖47种临床和兽医相关抗菌药物，依据EUCAST和CASFM兽医标准判定。ESBL表型经双纸片协同试验、ESBL NDP试验及NG-Test CTX-M MULTI侧向层析免疫测定确认。全基因组测序在Illumina NextSeq 500平台完成，一株代表性肺炎克雷伯菌ST17菌株O100C1另经Oxford Nanopore MinION测序以获得完整质粒序列。生物信息学分析包括耐药基因注释、多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）、质粒复制子分型、核心基因组MLST（cgMLST）系统发育分析，并使用Kleborate评估毒力评分。比较基因组分析纳入了Pathogenwatch上991株公开的肺炎克雷伯菌ST17基因组。
三、主要研究结果
（一）ESC耐药肠杆菌在野生动物和圈养动物中的分布
1,899份样本中，303份（16.0%）在含头孢噻肟选择性培养基上生长，其中圈养动物阳性率（198/365, 54.2%）远高于自由放养野生动物（105/1,521, 6.9%）。经药敏试验确认，共73份样本（3.9%）携带ESC耐药肠杆菌（ESC-R-E）。7株产OXA-48样碳青霉烯酶的菌株已在既往研究中表征，未纳入后续针对ESBL和头孢菌素酶的ESC耐药分析。其余66株ESC-R-E主要分离自圈养动物（47/365, 12.9%），其次为自由放养野生动物（18/1,521, 1.2%）和一名动物园工作人员（1/13, 7.7%）。菌种分布以肺炎克雷伯菌为主（n=33），其次为大肠埃希菌（n=29），另有肺炎克雷伯菌 quasipneumoniae 亚种（Klebsiella quasipneumoniae, n=2）和霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei, n=2）。
（二）超广谱头孢菌素耐药的分子机制
全部66株ESC-R-E均呈ESBL NDP试验阳性。NG-Test CTX-M MULTI鉴定出61株产CTX-M酶，其余5株呈头孢菌素酶表型。全基因组测序证实CTX-M酶是ESC耐药的主要机制：61株产CTX-M菌株中CTX-M-15占绝对优势（n=53），其次为CTX-M-27（n=5）、CTX-M-1（n=1）、CTX-M-2（n=1）和CTX-M-55（n=1）。两株2016年分离自鸽子的历史菌株也携带bla
CTX-M-15。质粒介导的AmpC β-内酰胺酶见于4株菌株，包括大肠埃希菌中的bla
CMY-145（n=2）和bla
CMY-141（n=1），以及K. quasipneumoniae subsp. quasipneumoniae中的bla
DHA-1。所有ESC-R-E菌株均呈现多药耐药表型，主要涉及青霉素类、第三和第四代头孢菌素、氨曲南、氨基糖苷类和氟喹诺酮类；多数菌株对碳青霉烯类仍敏感。
（三）产CTX-M-15肺炎克雷伯菌ST17在野生动物相关生态系统中的扩张
全基因组分析显示单一肺炎克雷伯菌谱系显著占优：35株克雷伯菌属菌株中27株属于肺炎克雷伯菌ST17，且全部携带bla
CTX-M-15。ST17菌株分布于多个地理位点和宿主类别，包括圈养哺乳动物和鸟类、自由放养野生鸟类及一名动物园工作人员。多数ST17菌株来自圈养动物（22/27），主要分离自阿尔及尔和吉杰尔的动物园；4株来自贝贾亚地区自由放养鸟类。这些菌株间的紧密遗传亲缘关系及其在不同宿主类别中的出现，表明一个高度保守的ST17谱系正在野生动物相关和动物园环境中循环传播。该ST17谱系携带荚膜位点KL25和O位点O5，但缺乏主要毒力相关决定因子，Kleborate毒力评分为0。ST17簇内较短的遗传距离符合近期从共同祖先分化而非多次独立引入的模式。其他克雷伯菌谱系包括：产CTX-M-15的ST29（分离自野生牛背鹭和圈养耳廓狐，相距约240 km，携带ybt14耶尔森菌素位点，毒力评分1）、ST219、ST323、ST348、ST584及高风险ST307。两株K. quasipneumoniae亚种菌株各自携带bla
DHA-1或bla
CTX-M-15，分别分离自圈养巴巴里地松鼠和迁徙白鹳。既往研究中表征的产OXA-48菌株虽属于不同ST，但显示较强的系统发育关联，提示bla
OXA-48通过质粒介导在既有谱系内近期获得，而非独立的克隆扩张。
（四）与产CTX-M-15肺炎克雷伯菌ST17相关的保守IncFIB(K)质粒
对代表性菌株O100C1的杂交测序获得完整基因组，包括5,157,420-bp染色体和三个环状质粒。最大质粒pO100C1为212,580-bp的IncFIB(K)质粒，携带包含bla
CTX-M-15的多药耐药区域，并同时含有bla
OXA-1、bla
TEM-1、catB3、qnrS1、sul1、dfrA12、aac(3)-Iia、aph(6)-Id、aph(3″)-Ib、aadA2、aac(6′)-Ib-cr和mph(A)等多种耐药基因，以及ISEcp1-bla
CTX-M-15-Tn3转座模块。其余ST17菌株的Illumina contig均包含同一多药耐药区域序列，读段比对显示整个质粒骨架在所有ST17菌株中均有覆盖，表明该谱系内存在高度相关的IncFIB(K)样质粒。与公开数据库比较发现，pO100C1与2020年危地马拉人类菌株来源质粒pGN4146-1共享99.99%的全序列核苷酸同一性；与2023年加沙ST225血流感染菌株质粒p1_6Gaza2023在96%的pO100C1序列上共享99.99%同一性；2016年加纳和2008年挪威ST17菌株携带的相关质粒则构成同一质粒家族中更为分歧的变异体，但仍保留保守的骨架组织和ISEcp1-bla
CTX-M-15-Tn3耐药模块。这表明该IncFIB(K)质粒谱系不局限于单一细菌序列型，并已在不同大洲、不同地理区域和不同宿主来源之间长期传播。
（五）肺炎克雷伯菌ST17的全球背景
为将阿尔及利亚ST17菌株置于全球背景下，研究人员对991株公开的ST17基因组与本研究27株ST17基因组进行了cgMLST分析。全球ST17种群呈现广泛的地理多样性，主要以人类相关菌株为主。阿尔及利亚ST17菌株形成一个高度相关的簇，符合近期在野生动物相关和动物园环境中的局部扩张。尽管局部聚集，阿尔及利亚菌株与来自不同大洲人类来源的ST17菌株存在遗传关联，表明该谱系共享全球共同种群结构。结合高度相关的IncFIB(K)-CTX-M-15质粒鉴定结果，这些发现支持成功的肺炎克雷伯菌ST17谱系在包括人类、圈养动物和野生动物相关环境在内的不同生态区间循环传播。
（六）产ESBL大肠埃希菌的种群多样性与传播模式
29株产ESBL/AmpC大肠埃希菌分布于六个系统发育群（A、B1、B2、C、D和F），以A群为主（12/29），其次为D群（8/29）和F群（6/29）。ST38谱系（n=6，D群）在贝贾亚、吉杰尔和塞提夫的圈养和自由放养动物中均有检出，5株携带bla
CTX-M-15，1株携带bla
CTX-M-27，形成紧密相关簇；2016年贝贾亚鸽子来源的产CTX-M-15菌株与该谱系聚集，提示ST38已持续存在于阿尔及利亚野生动物相关生态系统多年。产CTX-M-27的ST457谱系（n=4，F群）仅分离自相距约642 km的贝贾亚和奥兰动物园的圈养哺乳动物，形成紧凑的系统发育簇，支持跨区域传播。此外还检出多个国际公认的高风险克隆：ST361（n=3）中两株产CMY-145的分离自贝贾亚黄腿鸥，一株产CTX-M-15的分离自奥兰动物园巴巴里地松鼠；ST167和ST410各有1株。PBP3氨基酸插入分析发现，一株ST410携带YRIK插入及A413V替换，两株ST361携带YRIN插入及Q227H、E349K、I532L替换，其中ST361 O108B7和ST410 O100E9对氨曲南/阿维巴坦的MIC分别为4和16 μg/mL。将既往研究（PRJNA1242567）中产碳青霉烯酶的大肠埃希菌基因组纳入分析后，多个产碳青霉烯酶谱系（ST38、ST131、ST227、ST540、ST1135）与产ESBL动物菌株聚集，提示共享遗传背景；尤其是一株产OXA-48的ST38菌株与产CTX-M-15的ST38菌株聚集极为紧密。
（七）其他产β-内酰胺酶肠杆菌分离株
两株阴沟肠杆菌复合群菌株被鉴定：一株为E. hormaechei subsp. steigerwaltii ST88，分离自阿尔及尔动物园塞内加尔鹦鹉，携带blaLAP-2；另一株为E. hormaechei subsp. hormaechei ST269，分离自贝贾亚蝙蝠粪便，携带bla
CTX-M-15。这些ST在临床环境中较为罕见。
四、讨论与结论
本研究表明，圈养动物的ESC-R-E携带率（13.5%）显著高于自由放养野生动物（1.6%），动物园环境作为动物、人类和人为投入交汇的场所，可能是临床相关耐药决定因素维持和循环的重要生态区室。CTX-M酶（尤其是CTX-M-15）是ESC耐药的主导机制，与全球范围内其在人类、兽医和环境肠杆菌中的扩张一致。产CTX-M-15肺炎克雷伯菌ST17的优势地位是本研究最显著的发现之一：27/34株肺炎克雷伯菌属于ST17且均携带bla
CTX-M-15，该克隆携带KL25和O5荚膜位点但缺乏耶尔森菌素，毒力较低，其基因组成功可能由保守IncFIB(K)质粒的获得和维持所支撑。该质粒家族已在国际上传播至少15年，与危地马拉（2020年）、加沙（2023年）人类菌株质粒高度一致，其保守的ISEcp1-bla
CTX-M-15-Tn3模块构成稳定的ESBL耐药播散平台。相较之下，产ESBL大肠埃希菌呈现显著的种群多样性，但检出ST38、ST167、ST361、ST410等国际高风险克隆，其中ST38在阿尔及利亚野生动物相关环境中至少持续存在六年。PBP3插入突变在ST361和ST410中的检出，提示这些克隆可能对头孢地考和氨曲南/阿维巴坦敏感性降低。综合而言，本研究证明包括国际成功的肺炎克雷伯菌ST17和大肠埃希菌高风险克隆在内的产ESBL肠杆菌正在阿尔及利亚野生动物相关和动物园环境中循环传播，保守耐药质粒和与人类相关种群共享的细菌谱系的检出，凸显了AMR在生态区间传播的相互关联性。将野生动物纳入One Health监测计划，结合人类、动物和环境来源的基因组流行病学，对于阐明传播路径和设计限制抗菌药物耐药性扩散的有效策略至关重要。
