二甲双胍改善雌性糖尿病小鼠识别记忆、减轻神经元损伤并减少小脑淀粉样蛋白沉积

《Scientia Pharmaceutica》：Metformin Improves Recognition Memory, Attenuates Neuronal Damage, and Reduces Cerebellar Amyloid-like Deposits in Female Diabetic Mice

　　

2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM）与女性认知障碍和痴呆风险增加相关。研究人员研究了亚慢性二甲双胍治疗对雌性糖尿病小鼠识别记忆和脑病理的影响。通过链脲佐菌素和烟酰胺注射诱导T2DM。随后，小鼠经口给予二甲双胍（50、150或250 mg/kg），持续28天。采用新物体识别试验（Novel Object Recognition Test, NORT）评估识别记忆（n=72）。全脑匀浆的生化分析检测了胰岛素、tau蛋白和不溶性Aβ₄₂（n=4）。组织学分析评估了海马Cornu Ammonis 1（CA1）区、大脑皮层和小脑中的神经元损伤及淀粉样蛋白样沉积（n=4）。糖尿病小鼠表现出高血糖、高胰岛素血症、血脂异常、识别记忆受损和神经元损伤。二甲双胍降低血糖水平并改善识别记忆。二甲双胍还使血清和脑胰岛素水平正常化，并减轻CA1区、皮层和小脑的神经元损伤。二甲双胍减少了小脑刚果红阳性淀粉样蛋白样沉积，并降低全脑匀浆中不溶性Aβ₄₂水平。然而，在250 mg/kg剂量下，二甲双胍增加了总tau和磷酸化tau水平。这些结果表明，二甲双胍可减轻雌性小鼠的识别记忆缺陷、减轻神经元损伤并减少小脑淀粉样蛋白样沉积。

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）已成为21世纪重大公共卫生挑战，除心血管病、肾病和视网膜病变等代谢并发症外，还与认知功能受损及痴呆风险升高相关，其中女性T2DM患者的认知损害风险更高。糖尿病相关认知障碍（diabetes-associated cognitive impairment, DACI）的病理生理机制涉及脑胰岛素抵抗、氧化应激、慢性炎症、血脂异常以及淀粉样蛋白稳态紊乱。脑是胰岛素敏感器官，胰岛素信号受损可促进神经退行性变；外周高胆固醇血症还可能影响血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）完整性，进而有利于β-淀粉样蛋白（Aβ）积聚。既往研究多聚焦海马和大脑皮层，而海马Cornu Ammonis 1（CA1）区对代谢和氧化应激尤为敏感；小脑除运动控制外也可能参与认知过程，但受到的关注不足。二甲双胍可透过BBB，具有降糖以外的多效性作用，但关于其对淀粉样斑块积聚影响的证据仍稀缺且相互矛盾，且其tau蛋白相关效应呈剂量依赖性。此外，女性T2DM患者认知损害风险高于男性的机制尚不明确。为此，研究人员在雌性糖尿病小鼠模型中系统评价了亚慢性二甲双胍治疗对识别记忆及海马CA1区、大脑皮层和小脑区域特异性神经病理改变的影响，并检测淀粉样蛋白、tau蛋白、胆固醇以及血清和脑组织胰岛素水平，以更全面表征其代谢、行为和神经病理学效应。

研究人员采用72只购自墨西哥莫雷洛斯动物设施（Morelos vivarium）的8周龄雌性BALB/c小鼠，随机分为非糖尿病组、糖尿病组、糖尿病+生理盐水组及糖尿病+二甲双胍50、150、250 mg/kg组。以链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）+烟酰胺腹腔注射诱导T2DM，随后口服给药28天。采用新物体识别测试（novel object recognition test, NORT）评估识别记忆，并用rotarod排除运动障碍。生化检测血清胆固醇、血清及脑胰岛素、总tau和磷酸化tau（pS199）及不溶性Aβ₄₂；组织学用苏木精-伊红（H&E）染色评估胰腺与脑区损伤，用刚果红染色检测淀粉样蛋白样沉积，并用ImageJ定量。统计采用重复测量方差分析、单因素方差分析及Kruskal-Wallis检验。

3.1 二甲双胍对雌性2型糖尿病小鼠血糖、体重和食物摄入的影响：STZ联合烟酰胺诱导的糖尿病小鼠出现持续高血糖、体重波动和摄食增加；口服二甲双胍（50–250 mg/kg）显著降低血糖，150 mg/kg剂量在第28天将食物摄入恢复至接近非糖尿病水平，且未引起低血糖。

3.2 二甲双胍对识别记忆的影响：NORT显示，糖尿病组和糖尿病+生理盐水组从第7天起持续出现负向辨别指数且偏好指数低于50%，提示识别记忆受损；二甲双胍从第14天起显著提高辨别指数，第28天所有剂量均使辨别指数达约0.5、偏好指数约70%，改善程度主要与治疗持续时间有关。

3.3 二甲双胍对胆固醇、tau蛋白和胰岛素水平的影响：糖尿病小鼠血清胆固醇升高约20–22倍，二甲双胍150和250 mg/kg显著降低胆固醇，50 mg/kg无效；糖尿病小鼠血清胰岛素升高而脑胰岛素降低，二甲双胍各剂量均使其正常化；250 mg/kg二甲双胍升高脑内总tau、S199位点磷酸化tau（pS199）及其比值，较低剂量无此效应。

3.4 二甲双胍对胰腺、CA1区、大脑皮层和小脑形态的影响：糖尿病小鼠胰岛缩小、细胞密度降低、淋巴细胞浸润，腺泡结构紊乱；二甲双胍未恢复胰岛形态但减少淋巴细胞浸润。CA1区糖尿病导致锥体神经元密度降低、固缩和层状结构紊乱，150和250 mg/kg二甲双胍明显保护。大脑皮层糖尿病引起层状结构紊乱、神经元密度降低和空泡化，仅150 mg/kg显著改善皮层结构。小脑糖尿病导致颗粒层密度降低、浦肯野细胞丢失和固缩，150 mg/kg接近完全恢复，250 mg/kg部分改善。

3.5 二甲双胍对淀粉样蛋白样沉积的影响：刚果红染色显示糖尿病小鼠小脑浦肯野层和颗粒层出现阳性沉积，二甲双胍剂量依赖性地减少该沉积，250 mg/kg完全阻止；糖尿病小鼠全脑匀浆不溶性Aβ₄₂升高，二甲双胍剂量依赖性地降低。研究人员未进行CA1区、大脑皮层和小脑的局部Aβ₄₂定量。

讨论部分指出，该STZ-烟酰胺方案（累计STZ 260 mg/kg、烟酰胺30 mg/kg）在雌性BALB/c小鼠中成功诱导出持续高血糖、高胰岛素血症、血脂异常、多食和体重改变，且胰岛呈部分损伤而非完全破坏，符合T2DM特征。二甲双胍改善全身和脑胰岛素稳态、减轻血脂异常，可能通过维持BBB完整性等机制创造不利于蛋白聚集的环境。关于小脑淀粉样蛋白样沉积，由于小鼠Aβ与人类Aβ存在三个氨基酸差异且刚果红并非Aβ特异性染色，应解释为淀粉样蛋白样病理而非确定的Aβ斑块。最高剂量二甲双胍增加tau相关标志物，与既往关于二甲双胍对tau蛋白呈剂量依赖性矛盾效应的报道一致；高剂量不一定导致更高脑暴露，150 mg/kg的小脑二甲双胍浓度甚至高于300 mg/kg。讨论还列出局限性：未同步雌鼠动情周期、模型未能完全模拟人类T2DM、仅评估CA1区/大脑皮层/小脑且只采用H&E和刚果红染色、未测定AMPK和胰岛素降解酶（insulin-degrading enzyme, IDE）等分子通路、未纳入雄鼠比较、仅用NORT评估认知。

研究结论：亚慢性二甲双胍治疗（50、150和250 mg/kg）降低了雌性糖尿病小鼠的高血糖并改善了识别记忆。二甲双胍使血清和脑胰岛素水平正常化，在150和250 mg/kg剂量下降低血清胆固醇，并减轻了海马CA1区、大脑皮层和小脑的神经元损伤。二甲双胍还减少了小脑刚果红阳性淀粉样蛋白样沉积，并降低了全脑匀浆中不溶性Aβ₄₂水平。然而，最高剂量（250 mg/kg）虽改善了识别记忆，却增加了脑组织中总tau和磷酸化tau蛋白水平。这些结果表明，二甲双胍在该雌性糖尿病小鼠模型中产生了有益的代谢、行为和神经病理学改变；但最高剂量下tau相关标志物的升高强调需进一步研究二甲双胍对雌性糖尿病大脑的影响。