《Canadian Journal of Neurological Sciences》：Cytoplasmic TDP-43 Accumulation in Autosomal Recessive Spastic Ataxia of Charlevoix–Saguenay
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专业摘要翻译：背景：常染色体隐性痉挛性共济失调（Charlevoix–Saguenay型）（ARSACS）是一种罕见的早发性神经退行性疾病，以进行性小脑性共济失调、痉挛状态和周围神经病为特征。该病由SACS基因双等位基因突变引起，SACS基因编码sacin蛋白
专业摘要翻译：背景：常染色体隐性痉挛性共济失调（Charlevoix–Saguenay型）（ARSACS）是一种罕见的早发性神经退行性疾病，以进行性小脑性共济失调、痉挛状态和周围神经病为特征。该病由SACS基因双等位基因突变引起，SACS基因编码sacin蛋白（sacsin），这是一种涉及细胞骨架组织、线粒体稳态及蛋白质质量控制的大型蛋白。尽管对sacsin生物学功能的认识不断深入，但ARSACS中神经退行性变背后的分子机制仍未完全阐明。研究人员在此首次报道了ARSACS中病理性TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）积聚的神经病理学证据。方法：研究人员对一例经遗传学确诊、携带魁北克创始者突变纯合子（SACS c.8844delT）的ARSACS患者可获得的死后脑组织进行了免疫组织化学、免疫荧光和生化分级分离分析。结果：前额叶皮质、运动皮质和小脑中的神经元表现出细胞质内磷酸化点状TDP-43（pTDP-43）聚集体，并伴核定位减少。生化分级分离进一步鉴定了ARSACS组织中的去垢剂不溶性TDP-43蛋白形式。其他病理特征包括神经丝积聚增加、神经元空泡样改变、浦肯野细胞丢失及p62阳性细胞质包涵体。在第二例ARSACS病例中观察到类似的点状细胞质pTDP-43聚集体。结论：这些发现将pTDP-43认定为ARSACS中一项此前未被识别的病理学特征。尽管该患者未表现出肌萎缩侧索硬化的临床或组织病理学征象，但在ARSACS中观察到的非典型pTDP-43聚集体可能代表一种罕见的、继发性的、早期阶段的或潜在未被充分认识的TDP-43病理表现，而非该疾病的界定性标志物。需要对更多患者及实验性ARSACS模型进行进一步研究，以确定TDP-43异常在该疾病中的患病率及机制基础。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
常染色体隐性痉挛性共济失调（Charlevoix–Saguenay型）（autosomal recessive spastic ataxia of Charlevoix–Saguenay, ARSACS）是一种罕见的早发性神经退行性疾病，以进行性小脑性共济失调、痉挛状态和周围神经病为核心临床特征。该病于1978年在加拿大魁北克省首次报道，随后在全球范围包括美国、印度、土耳其、日本及欧洲多国均有发现。在魁北克创始者人群中，其发病率约为每1932例活产儿中1例，但全球患病率仍未明确。ARSACS的致病基因为SACS，位于染色体13q12，编码sacsin蛋白——一种参与神经丝（neurofilament, NF）组织、线粒体功能维持及蛋白质质量控制的大型蛋白。在魁北克人群中，SACS基因c.8844delT创始者突变占绝大多数病例，患者通常呈现相对同质的早发表型。然而，随着全球范围内大量突变的鉴定，ARSACS已被认识到是一种泛民族表型神经退行性疾病，非魁北克变异往往伴随更广泛的临床异质性。
尽管对sacsin生物学的研究不断深入，ARSACS中神经退行性变的分子机制仍未完全阐明。已知sacsin缺失可导致神经元代谢功能障碍，包括溶酶体转运和微管动力学改变、神经丝组装和动力学受损、自噬通路受损及p62/SQSTM1表达增加等。然而，TAR DNA结合蛋白43（TAR DNA-binding protein 43, TDP-43）这一在肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）和额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration, FTLD）中发挥核心作用的RNA/DNA结合蛋白，此前从未在ARSACS中被系统研究。TDP-43病理学已被报道存在于越来越多的神经退行性疾病中，但ARSACS是否涉及TDP-43异常仍是空白。因此，研究人员旨在通过一例遗传学确诊的ARSACS患者的死后脑组织，系统评估是否存在TDP-43病理学改变，以填补这一认知空白，并探讨ARSACS与TDP-43蛋白病谱系之间可能存在的分子机制联系。
二、研究内容与结论概述
研究人员对一例经遗传学确诊、携带SACS c.8844delT纯合创始者突变的四十余岁男性ARSACS患者进行了全面的神经病理学分析。该患者临床表型典型，早年起病，表现为运动里程碑延迟、进行性步态共济失调和痉挛状态，疾病过程中未出现下运动神经元受累的临床证据。由于与进行性身体功能衰退相关的难治性心理痛苦，患者根据加拿大魁北克省法律和伦理准则选择了医疗协助死亡（medical assistance in dying, MAiD），这为获取保存完好的死后组织提供了条件。研究人员同时纳入了一例散发性肌萎缩侧索硬化（sporadic ALS, sALS）患者的死后组织作为阳性对照，以及一例六十余岁女性ARSACS患者的小脑组织作为独立验证样本。
通过免疫组织化学、免疫荧光和生化分级分离技术，研究人员在ARSACS患者的前额叶皮质、运动皮质和小脑中均检测到神经元胞质内点状磷酸化TDP-43（phosphorylated TDP-43, pTDP-43）聚集体（dot-like aggregates），并伴有核染色减少或缺失，符合病理性TDP-43错误定位的特征。在第二例独立ARSACS病例的小脑组织中同样观察到类似的点状pTDP-43聚集体，支持了该发现的可重复性。生化分析表明，ARSACS额叶皮质中存在去垢剂不溶性的TDP-43蛋白形式，尽管其水平低于ALS样本。此外，研究人员还观察到神经丝轻链（neurofilament light, NF-L）免疫反应性增强、神经元胞体增大伴空泡样结构、浦肯野细胞丢失以及p62阳性细胞质包涵体等病理特征。与ALS病例的比较显示，ARSACS中的pTDP-43病理在区域分布和形态学上均存在明显差异：ALS运动皮质中可见丰富的丝状或大颗粒状胞质包涵体，而ARSACS组织则以小致密点状聚集体为主，且在小脑中更为突出。定量分析证实了这些区域差异的统计学意义。
这些发现首次提供了ARSACS中存在pTDP-43病理学的神经病理学证据，将ARSACS与TDP-43蛋白病谱系建立了潜在联系。尽管该患者无ALS的临床或组织病理学征象，但非典型pTDP-43聚集体的存在提示其可能代表一种罕见的、继发性的、早期阶段的或此前未被充分认识的TDP-43病理表现。这一发现提出了ARSACS与其他TDP-43驱动的疾病之间可能存在共享分子机制的假说，为未来研究开辟了新的方向。
三、主要关键技术与方法
研究人员采用了以下核心技术方法：①对5μm厚石蜡切片进行免疫组织化学染色（immunohistochemistry, IHC），使用抗pTDP-43 Ser409/410、抗p62和抗NF-L抗体，由魁北克大学医院病理科执行标准化染色程序；②免疫荧光（immunofluorescence, IF）染色，使用抗天然及磷酸化TDP-43抗体和抗β-微管蛋白III（TUJ-1）抗体，通过LSI 700共聚焦显微镜成像；③顺序去垢剂提取法（sequential detergent extraction）制备sarkosyl可溶与不可溶蛋白组分，适应自Tamaki等（2023）的方案；④Western blotting检测各组分中TDP-43蛋白水平，使用Bradford法进行蛋白定量，以2,2,2-三氯乙醇辅助总蛋白可视化。定量评估采用双盲法，由两名独立观察者在400倍放大下对每个脑区50个随机视野手动计数细胞质pTDP-43阳性神经元，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey事后检验进行统计比较。样本来源包括一例遗传学确诊的ARSACS索引患者（魁北克创始者突变纯合子）、一例52岁sALS患者和一例六十余岁女性ARSACS患者，均通过相同的MAiD相关组织捐献程序获取。
四、研究结果详解
IHC及IF分析揭示了索引ARSACS患者多个脑区神经元中存在细胞质点状pTDP-43聚集体。在所有检测区域中，受累神经元均表现出特征性的胞质包涵体及核染色减少或缺失，符合pTDP-43病理性错误定位的特征。小脑作为ARSACS中显著受累的区域，除了预期的浦肯野细胞密度降低和树突树异常分支外，还显示出广泛的pTDP-43阳性点状聚集体，提示pTDP-43积聚可能参与ARSACS的小脑病理过程。脊髓中的pTDP-43免疫反应性仅局限于少量神经元，且未检测到明显的神经元增大或异常p62染色。
免疫组织化学还显示，索引ARSACS患者的多个脑区（包括前额叶皮质、运动皮质和小脑）中NF-L免疫反应性增加。与已知的ARSACS神经病理学特征一致，残存的浦肯野细胞和大脑皮质外锥体层3（Lamina III）神经元表现出显著的躯体树突状神经丝积聚。在前后额叶和运动皮质中观察到含有胞体空泡样区域的增大神经元，伴随明显的NF-L积聚和细胞体中局灶性NF阴性隆起，提示异常胞质蛋白积聚。同时注意到NF-L阳性浦肯野细胞数量减少，与浦肯野细胞退行性变一致。此外，神经元中观察到p62的异常积聚。p62是自噬的关键蛋白标志物，其胞质聚集提示自噬降解功能受损，这种积聚通常与慢性蛋白稳态应激、神经炎症和神经退行性变相关。
为了更清晰地界定ARSACS中pTDP-43病理的特征，研究人员将同一ALS患者的相同脑区作为阳性对照进行了平行IHC分析。ALS运动皮质中可见丰富的胞质包涵体，常表现为神经元内的丝状或大颗粒状聚集体；这些聚集体在前额叶皮质中较少见，在小脑中罕见。相比之下，ARSACS患者在小脑中显示出显著的TDP-43免疫反应性，在浦肯野细胞层内观察到小而致密的点状聚集体。类似的点状聚集体在运动皮质和前额叶皮质中偶尔也可检测到。与ALS病例不同，ARSACS组织仅显示这种小点状的pTDP-43聚集模式。定量分析支持了这些区域差异：ALS患者运动皮质中pTDP-43阳性细胞比例显著高于ARSACS患者，而ARSACS患者小脑中TDP-43阳性细胞比例更高。单因素ANOVA及Tukey事后检验确认了这些区域趋势的统计学意义（p < 0.05）。
顺序去垢剂提取结合Western blotting分析人死后额叶皮质组织中的不溶性TDP-43。如预期所示，ALS样本在sarkosyl不溶组分中呈现强TDP-43信号。ARSACS样本也显示出可检测的不溶性TDP-43，尽管水平低于ALS病例。这些发现支持了免疫组织化学所观察到的TDP-43错误定位和聚集的证据。
在脊髓中，TDP-43免疫反应性虽可检测到但仅限于少量神经元。未在脊髓中检测到明显的增大神经元或异常p62染色。
五、讨论总结与研究结论
研究发现与既往关于ARSACS蛋白稳态受损、自噬功能障碍和细胞骨架紊乱的研究一致。sacsin缺乏可能导致神经丝异常积聚（在ARSACS患者小脑和大脑皮质中均有体现）；同时p62的积聚和自噬标志物表达增加提示自噬降解途径受损，这为解释ARSACS中TDP-43的异常定位提供了机制线索；而TDP-43从细胞核向细胞质的异常转移被认为是下游的病理事件。
研究人员指出，有若干观察结果不支持该ARSACS病例存在伴随或亚临床ALS：（1）缺乏下运动神经元体征；（2）缺乏ALS相关的典型线状（skein-like）TDP-43包涵体；（3）TDP-43病理的区域分布和形态学特征与ALS明显不同。TDP-43异常可发生于ARSACS，可能代表该疾病的罕见表现或此前未被充分认识的特征，因为TDP-43染色并非该疾病的常规评估项目。
本研究同时提出，ARSACS与其他TDP-43蛋白病（包括ALS和FTLD）之间可能存在共享的分子机制。这一平行关系也颇具意义，因为ARSACS晚期阶段已报道存在认知损害，且可能与FTLD中观察到的行为和 executive 功能障碍存在某些共性。两种疾病均涉及运动神经元参与，并共享诸如痉挛状态、远端肌肉萎缩和反射亢进等临床特征。尽管ALS通常在成年期发病且表现为快速进行性无力，而ARSACS在儿童期起病，但重叠的神经系统特征指向共享疾病机制的可能性。研究最终结论认为：这些发现将pTDP-43认定为ARSACS中一项此前未被识别的病理学特征。尽管索引患者无肌萎缩侧索硬化的临床或组织病理学证据，但ARSACS中观察到的非典型pTDP-43聚集体可能代表TDP-43病理的罕见、继发、早期或潜在未被充分认识的表现，而非该疾病的界定性特征。该结论提示，需要在更多患者及实验模型中进一步探讨TDP-43异常在ARSACS中的患病率和机制基础。
