《Veterinary Sciences》：Feline-Derived Lactiplantibacillus plantarum–Aloe Vera Polysaccharide Hydrogel as a Topical Control Strategy for Staphylococcus pseudintermedius-Infected Wounds
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假中间葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius, SP）是伴侣动物重要的机会性病原体，而耐药菌株流行率的增加凸显了对局部感染控制替代策略的需求。本研究评估了一种含有猫源植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plan
假中间葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius, SP）是伴侣动物重要的机会性病原体，而耐药菌株流行率的增加凸显了对局部感染控制替代策略的需求。本研究评估了一种含有猫源植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum ZYpet-014）和芦荟多糖（Aloe vera polysaccharides, AVEs）的局部用水凝胶对SP感染伤口的治疗效果。芦荟多糖促进了植物乳杆菌的生长和有机酸产生，并改善了其在卡波姆水凝胶中的短期存活率。含植物乳杆菌与芦荟多糖的水凝胶在体外抑制了浮游SP生长和生物膜形成，并引起SP细胞显著的形态破坏。研究人员进一步利用SP攻击的全层小鼠伤口模型评估了其治疗效果。含植物乳杆菌与芦荟多糖的治疗加速了伤口闭合，在第14天达到95.75%，同时定性组织学观察提示组织改善及胶原相关染色模式的差异。治疗还与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）水平降低，以及白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β1（TGF-β1）和血清血管内皮生长因子（VEGF）浓度升高相关。在伤口组织中，含植物乳杆菌与芦荟多糖的治疗降低了CD80免疫反应性并增加了CD206免疫反应性，这与巨噬细胞相关反应向修复型转变一致。此外，16S rRNA基因测序显示处理伤口中葡萄球菌属相对丰度降低，乳酸杆菌属相对丰度升高。综上所述，这些发现证明了该制剂在体外具有抗SP活性和抗生物膜活性，同时在体内伴随伤口愈合改善、炎症反应调节和伤口微生物组成变化，尽管伤口组织中SP负荷的直接减少仍有待确认。
研究背景与目的
假中间葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius, SP）是伴侣动物，尤其是犬类皮肤和软组织感染的主要机会性病原体。随着耐甲氧西林假中间葡萄球菌（methicillin-resistant S. pseudintermedius, MRSP）等多重耐药菌株的增多，以及SP生物膜形成能力的增强，传统抗生素治疗面临严峻挑战。SP还具备人畜共患潜力，可在犬主间传播，凸显了从“同一健康”角度开发非抗生素局部治疗策略的紧迫性。益生菌，特别是植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum, LP），因其抑制病原体生长、干扰生物膜及调节炎症反应的潜力而受到关注。芦荟多糖（Aloe vera polysaccharides, AVEs）则具有促进成纤维细胞增殖、调节炎症和促进组织修复的生物活性。基于此，研究人员假设将猫源LP菌株ZYpet-014与AVE结合于卡波姆水凝胶中，可构成一种多功能、非抗生素的局部策略，用于对抗SP相关的伤口感染。
主要技术方法
- 1.
细菌菌株与材料：使用从健康家猫粪便中分离的LP菌株ZYpet-014（保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC），以及标准SP菌株（ATCC 49444）。芦荟衍生物（AVE）为商业采购品。
- 2.
体外实验：
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通过测定OD600和活菌计数评估不同浓度AVE对LP生长的促进作用。
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采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用（UHPLC-MS）定量分析LP在有或无AVE条件下的有机酸产量。
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通过琼脂扩散法、活菌计数法和结晶紫染色法评估水凝胶配方对浮游SP生长和附着生物量的抑制作用。
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使用扫描电子显微镜（SEM）观察经水凝胶条件培养基处理后SP的形态变化。
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利用SYTO 9/碘化丙啶（PI）双荧光染色评估LP在水凝胶中短期储存后的膜完整性。
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检测水凝胶的溶胀行为、pH变化及溶血率。
- 3.
体内动物实验：
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建立SP感染的小鼠全层皮肤缺损伤口模型，动物分为五组：未感染对照组、感染未治疗模型组、空白水凝胶组、含LP水凝胶组、含LP+AVE水凝胶组。
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定期拍摄伤口照片并使用ImageJ软件计算伤口闭合率。
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在第7天和第14天取伤口组织进行苏木精-伊红（H&E）、Masson三色和天狼星红染色，定性评估组织学和胶原特征。
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通过免疫荧光染色检测伤口组织中TNF-α、IL-10、CD80和CD206的表达。
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使用商品化ELISA试剂盒检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、TGF-β1和VEGF的水平。
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对伤口组织进行16S rRNA基因（V3-V4区）高通量测序，分析微生物群落组成。
研究结果
3.1 AVE促进LP生长和有机酸产生
在2.5–40 mg/mL浓度范围内，AVE补充总体上增强了LP的生长，其中5 mg/mL浓度下活菌产量最高。在此浓度下，LP+AVE组的乳酸和乙酸等有机酸产量显著高于单独LP培养组。
3.2 短期储存后LP在水凝胶中的荧光评估
SYTO 9/PI染色显示，LP-水凝胶和LP+AVE-水凝胶中LP的相对SYTO 9荧光比例显著高于游离LP组，表明水凝胶基质有助于维持LP的膜完整性。
3.3 卡波姆水凝胶支持LP的掺入
SEM图像证实，LP成功掺入水凝胶的多孔三维结构中，并保持了其典型的杆状形态。
3.4 含LP水凝胶表现出良好的溶胀性、酸化和血液相容性
含LP的水凝胶组显示出更高的溶胀比和更明显的pH下降，表明LP持续代谢产酸。所有水凝胶配方的溶血率均低于5%，表明具有良好的血液相容性。
3.5 LP+AVE-水凝胶在体外对SP发挥抗菌和抗生物膜活性
琼脂扩散和活菌计数实验显示，含LP的水凝胶能有效抑制SP生长，且LP+AVE-水凝胶的抑菌圈直径和终点活菌数均优于LP-水凝胶。结晶紫染色表明，LP+AVE-水凝胶能更显著地减少总附着生物量。SEM观察到，经LP+AVE-水凝胶条件培养基处理后，SP细胞出现不规则塌陷等严重形态损伤。
3.6 局部应用LP+AVE-水凝胶加速SP感染伤口的闭合
在小鼠模型中，重复测量方差分析显示处理效应显著。到第14天，LP+AVE-水凝胶组的平均伤口闭合率达到95.75%，显著高于感染模型组（78.34%），但与LP-水凝胶组（93.46%）无统计学显著差异。
3.7 伤口修复过程中表皮覆盖和胶原组织的定性组织学特征
H&E染色显示，LP+AVE-水凝胶处理组在第7天即表现出较连续的表皮覆盖和更有序的组织结构。Masson三色和天狼星红染色表明，该组胶原相关细胞外基质的分布和组织更佳，尤其在伤口修复后期。
3.8 LP+AVE-水凝胶减弱局部TNF-α并增强IL-10免疫反应性
免疫荧光结果显示，在第14天，LP+AVE-水凝胶处理组伤口组织中的TNF-α荧光强度显著低于模型组，而IL-10荧光强度则显著高于模型组。
3.9 LP+AVE-水凝胶使CD80/CD206免疫反应性转向修复相关表型
与模型组相比，LP+AVE-水凝胶处理组在第7天和第14天均表现出显著升高的CD206（修复型巨噬细胞标志物）免疫反应性和显著降低的CD80（促炎型巨噬细胞标志物）免疫反应性。
3.10 LP+AVE-水凝胶调节全身性炎症和修复相关介质
第14天的血清ELISA结果显示，与模型组相比，LP+AVE-水凝胶显著降低了促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，同时显著提高了抗炎因子IL-4、IL-10以及修复相关因子TGF-β1和VEGF的水平，部分指标恢复至接近未感染对照组水平。
3.11 LP+AVE-水凝胶与感染伤口微生物群重塑相关
16S rRNA基因测序显示，LP+AVE-水凝胶处理组的伤口微生物群中，葡萄球菌属（Staphylococcus）的相对丰度降低，而乳酸杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度升高。探索性Spearman相关性分析提示，葡萄球菌属丰度与促炎因子呈正相关，而乳酸杆菌属丰度与之相反。
总结与讨论
本研究为概念验证性证据，证明由猫源LP菌株ZYpet-014、商业AVE和卡波姆基质组成的局部水凝胶，可作为对抗SP伤口感染的非抗生素替代策略。该配方在体外展现出对SP的抑制活性，并在小鼠感染模型中与加速伤口闭合、调节炎症反应、改变巨噬细胞标志物表达模式以及重塑伤口微生物群落相关联。然而，研究存在若干局限性：未设置单独的AVE水凝胶对照组，无法排除AVE的独立贡献；未量化伤口组织中的绝对SP载量，无法确定体内杀菌效果；LP菌株和配方制剂的表征尚不充分，缺乏长期稳定性、流变学特性和临床前安全性数据。尽管如此，这些发现为开发针对兽医临床耐药问题的宿主相关益生菌局部疗法提供了初步基础。
研究结论
总之，本研究表明，含有猫源植物乳杆菌ZYpet-014和芦荟多糖的局部水凝胶作为一种非抗生素局部策略，在对抗假中间葡萄球菌相关伤口感染方面具有潜力。
