《Journal of Freshwater Ecology》：Temporal variations in the gut microbiota of Mergus Squamatus wintering in the Xin’anjiang River Basin
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为探究濒危物种Mergus squamatus越冬期肠道微生物群落的时间动态特征，本研究于2023年10月至2024年3月在中国黄山新安江流域对越冬种群开展研究。研究人员通过非损伤采样共采集25份粪便样本，并进行16S rRNA基因扩增子测序（16S rRNA
为探究濒危物种Mergus squamatus越冬期肠道微生物群落的时间动态特征，本研究于2023年10月至2024年3月在中国黄山新安江流域对越冬种群开展研究。研究人员通过非损伤采样共采集25份粪便样本，并进行16S rRNA基因扩增子测序（16S rRNA gene amplicon sequencing），系统分析不同越冬阶段肠道微生物群的物种组成、相对丰度和多样性变化。结果表明，越冬M. squamatus肠道微生物群的核心优势门为Firmicutes（38.13%–73.71%）、Proteobacteria（17.31%–37.95%）、Bacteroidetes（2.43%–4.28%）和Actinobacteria（0.9%–3.79%）。α多样性（Alpha diversity）分析显示，Chao1和ACE指数（物种丰富度估计量，estimators of species richness）一致表明，前冬和中冬的微生物丰富度显著高于后冬（p < 0.05），在整个越冬过程中总体呈显著下降趋势。就多样性而言，Shannon和Simpson指数仅检测到前冬多样性水平显著高于中冬和后冬（p < 0.05），而中冬与后冬之间无显著差异。β多样性（Beta diversity）分析进一步证实，前冬与其他两个阶段的微生物群落结构存在显著差异，其中前冬与后冬差异最明显，中冬与后冬高度相似。基于这些结果，研究人员推断，M. squamatus肠道微生物群在中后冬发生方向性结构重塑，以适应越冬地栖息地选择压力。研究结果为评估越冬M. squamatus生理健康提供微生态基础，也为制定该稀有物种的栖息地保护策略提供关键参考。
研究背景与问题：肠道微生物群（gut microbiota）在宿主生长发育、营养吸收和免疫防御中发挥关键作用。现有动物肠道微生物研究多集中于家养动物（48.2%）和模式动物（37.5%），野生动物仅约14.3%，部分原因在于野生动物生活史复杂。环境因素深刻影响鸟类肠道微生物群；野生鸟类较其他动物类群有更多机会被高丰度微生物群落定植，迁徙鸟类跨越变化栖息地时肠道微生物群发生改变，甚至与环境微生物趋同。已有研究显示停歇时间、越冬持续时间影响生理状态、应激水平和行为活动，进而影响肠道微生物生态系统；对Grus grus和Grus nigricollis的研究发现不同越冬阶段微生物群落结构和多样性存在差异（Dong et al.（2019）；Zhao et al.（2021））。然而国内外迁徙鸟类肠道微生物研究仍有限。Mergus squamatus为中国国家一级保护野生动物，被列入IUCN红色名录和BirdLife International受威胁鸟类红色名录，是生态质量指示物种；其主要在东北和俄罗斯西伯利亚繁殖，越冬于长江以南、日本和韩国，越冬季约六个月。繁殖地、停歇地和越冬地栖息地特征差异显著，迁徙和越冬期长，可能显著影响肠道微生物群，但相关研究较少。因此研究人员在黄山新安江流域对M. squamatus前冬、中冬和后冬三个时期肠道微生物群适应性变化开展研究，以揭示野生水鸟越冬期肠道微生物群结构动态演化规律，为理解其微生态适应机制、评估野生鸟类生理健康和制定保护策略提供科学依据。
研究人员开展的研究及意义：研究人员以越冬M. squamatus为对象，分析不同越冬阶段肠道微生物群组成、丰富度和群落结构变化，结论为越冬期肠道微生物群丰富度总体下降、前冬多样性最高，前冬与中后冬群落结构显著分化，中冬与后冬高度相似；该研究为评估越冬M. squamatus生理健康、理解野生水鸟微生态适应及制定栖息地保护策略提供参考。
关键技术方法：样本队列来源为2023年10月至2024年3月中国黄山新安江流域率水和练江流域越冬M. squamatus种群，采用非损伤采样（non-invasive sampling）收集25份粪便样本；提取基因组DNA后针对16S rRNA基因V3–V4高可变区（hypervariable region）进行扩增子测序；原始数据经质控、拼接，以97%相似度聚类为操作分类单元（operational taxonomic units, OTUs），基于RDP数据库分类注释；计算α多样性（Alpha diversity）和β多样性（Beta diversity），采用UniFrac距离和主坐标分析（Principal Coordinates Analysis, PCoA），以置换多元方差分析（Permutational Multivariate Analysis of Variance, PERMANOVA）和相似性分析（analysis of similarities, ANOSIM）检验群落差异，以线性判别分析效应量（Linear discriminant analysis Effect Size, LEfSe）筛选差异分类单元，并用SPSS 26进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。
研究结果：3.1 研究样本总OTU数：对25份粪便样本进行16S rRNA基因高通量测序，获得2,423,820条序列，平均约96,953条/样本；97%相似度聚类得到9466个OTUs。OTU数在中冬最高（419.000 ± 66.840），后冬最低（285.900 ± 37.470）；前冬与中冬无显著差异，均显著高于后冬（p < 0.05）。物种累积曲线随样本量增加趋于平台，提示采样深度足以覆盖多数微生物多样性。Venn分析显示三阶段共1911个OTUs，共享442个；前冬独有164个（16%），中冬独有579个（37%），后冬独有162个（21%），说明肠道微生物群组成随越冬阶段发生明显变化并具阶段特异性。
3.2 Alpha多样性分析：Chao1和ACE指数显示前冬和中冬丰富度显著高于后冬（p < 0.05）；Chao1分别为521.50 ± 75.13、506.70 ± 67.06和343.90 ± 37.67，ACE分别为556.60 ± 70.24、542.50 ± 67.49和351.80 ± 34.31。Shannon指数前冬（2.84 ± 0.23）显著高于中冬（2.39 ± 0.22）和后冬（2.40 ± 0.19）（p < 0.05），中冬与后冬无显著差异；Simpson指数前冬最高（0.87 ± 0.03），中冬（0.80 ± 0.03）与后冬（0.81 ± 0.03）无显著差异。结论为越冬期肠道微生物群丰富度总体显著下降，多样性前冬最高。
3.3 Beta多样性分析：PERMANOVA和ANOSIM显示前冬与中冬、前冬与后冬群落结构差异显著，前冬与后冬差异最明显（ANOSIM R = 0.647）；中冬与后冬无显著差异（PERMANOVA F = 1.030，p = 0.337）。PCoA显示样本随时间出现明显聚类趋势，支持前冬与其他阶段群落结构不同、中冬与后冬高度相似。
3.4 越冬期M. squamatus肠道微生物组成分析：分类注释得到23门、56纲、97目、199科、458属、701种。优势门包括Firmicutes（38.13%–73.71%）、Proteobacteria（17.31%–37.95%）、Bacteroidetes（2.43%–4.28%）、Cyanobacteria和Actinobacteria（0.9%–3.79%）。Firmicutes中冬（73.71% ± 2.1%）和后冬（59.05% ± 5.3%）显著高于前冬（38.13% ± 2.6%）（Pre vs Mid p < 0.01；Pre vs Post p < 0.05）；Proteobacteria前冬（37.92% ± 2.0%）显著高于中冬（17.31% ± 1.5%，p < 0.01）和后冬（31.52% ± 2.8%，p < 0.05）；前冬Firmicutes与Proteobacteria无显著差异（p > 0.05）。Fusobacteria仅前冬可定量（16.91% ± 1.2%），显著高于中冬和后冬（均p < 0.01）；Actinobacteria前冬（2.86% ± 0.5%）显著低于中冬（3.12% ± 0.4%，p < 0.05）和后冬（5.13% ± 0.6%，p < 0.01）；Deinococcus-Thermus仅前冬检出（1.25% ± 0.2%，均p < 0.05）。属水平上，前冬以Plesiomonas（21.44%）、Cetobacterium（15.26%）和Lactobacillus（10.43%）为主；中冬以Lactobacillus（29.20%）、Catellicoccus（20.81%）和Peptostreptococcus（14.25%）为主；后冬以Acetanaerobacterium（17.59%）、Achromobacter（17.07%）、Acidisphaera（17.04%）和Aciditerrimonas（13.82%）为主。Acinetobacter从前冬1.85%升至中冬2.05%和后冬3.37%，后冬显著高于前冬（p < 0.05）；Lactobacillus前冬10.43%，中冬升至29.20%，后冬降至0.0025%，中冬显著高于前冬（p < 0.05）和后冬（p < 0.01）。LEfSe分析（LDA > 2.0）共识别139个显著差异分类单元：前冬97个（>69.7%），其中28个极显著（p < 0.0001）、33个高显著（p < 0.010）；中冬18个，1个极显著、5个显著，最高LDA值为5.225；后冬24个，无极高显著，2个显著、22个一般显著。前冬以Proteobacteria和Fusobacteria为主，Plesiomonas最具代表性；中冬以Firmicutes和Actinobacteria为主，Bacilli最具代表性；后冬以Proteobacteria和Actinobacteria为主，Campylobacteraceae为核心，Campylobacter最具代表性。潜在机会致病菌（opportunistic pathogens）属包括Escherichia、Clostridium、Plesiomonas、Campylobacter、Bacillus、Mycoplasma、Lysobacter和Fusobacterium，主要见于前冬。
讨论部分总结：原文认为，越冬期共有442个OTUs提示肠道微生物群总体较稳定，但各阶段独有OTUs显示阶段独特性。α和β多样性显示前冬丰富度和多样性最高，前冬与后续阶段群落结构差异显著，可能与迁徙行为、宿主应激反应和栖息地差异有关；中后冬趋于均质化，可能与越冬推进过程中非必需或环境敏感微生物类群丢失，以及环境变化、食物资源转变和生理应激共同作用有关。门水平优势门与繁殖地研究一致，但相对丰度差异明显；Yang et al.（2024）在长白山繁殖地报道Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria为优势门。原文分析认为，Bacteroidetes较高可能与经代谢产生丙酸促进糖异生和增加饱腹感、环境与饮食差异及其基因组可塑性有关；Actinobacteria越冬地低于繁殖地并从前冬到中后冬增加，与饮食变化有关；Proteobacteria冬季高于繁殖季，可能与机会致病菌、越冬环境微生物暴露和饮食转变有关；Escherichia和Plesiomonas的检出可能与长距离迁徙削弱肠黏膜屏障、机会致病菌定植及新环境微生物生态位定植有关。Fusobacteria前冬高丰度、后降至<1%，原文认为可能与其产丁酸促进脂肪积累和增强免疫有关；Deinococcus-Thermus仅前冬检出，功能尚不清楚，原文推测为迁徙中获得的外源瞬态微生物，需进一步研究。Lactobacillus中冬峰值可能通过促进短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）合成加速宿主能量储备积累；Acinetobacter累积增加可能与环境暴露或宿主免疫调节有关；后冬以耐酸和寡营养类群为主，可能与适应低温、食物资源变化等生态压力有关。LEfSe分析中，前冬Proteobacteria判别分类单元达峰（32个），与该门兼具潜在致病和共生功能双重性一致；Proteobacteria异常增加通常与肠道炎症相关，过度富集可能增加肠屏障损伤风险。中后冬Firmicutes和Actinobacteria呈互补分布，原文推测Firmicutes（如Lactobacillus）在短链脂肪酸代谢方面具优势、Actinobacteria（如Bifidobacterium）参与免疫调节，可能满足越冬M. squamatus“高效能量供应和免疫保护”的双重需求。后冬Planctomycetota等罕见差异门富集，原文推测可能是宿主肠道对越冬地生态环境的响应信号，也可能与后冬栖息地或食物资源变化有关，并为黄山栖息地适宜性提供微生态初步证据。
研究结论部分翻译：研究结论指出，随着越冬时间增加，肠道微生物群多样性发生变化，前冬与后冬阶段差异显著。原文推测，前冬M. squamatus利用先前获得的多样环境微生物满足长距离迁徙的代谢需求；中后冬在选择性压力下肠道微生物结构发生显著重塑，以适应环境变化（帮助恢复越冬期间生理损失）并为随后北迁作准备。这些推测有助于揭示M. squamatus肠道微生物群结构变化与其生态适应性的密切联系。原文同时指出需进一步考虑：研究依赖97%相似度阈值的OTU聚类，可能因算法偏差降低近缘微生物分辨率，未来可采用ASV方法在更细尺度验证；采样困难和样本量较小可能限制结果推广，未来应探索迁徙过程中微生物群变化的具体机制及其对宿主健康的影响；当前研究未在原始实验设计中设置阴性、阳性或mock-community对照，原文承认这是当前工作的局限。鉴于M. squamatus对生态环境高度敏感，栖息地保护对维持其肠道微生物群稳定性和多样性至关重要，深入研究其肠道微生物群可为野生鸟类保护提供新视角。原文实践建议为：将微生物群落监测作为生态健康预警指标，动态评估不同越冬阶段环境压力对M. squamatus种群的影响；将微生物因素纳入栖息地修复，通过改善环境栖息地因素间接维护M. squamatus肠道健康。
