利用小鼠阴道类器官与人阴道球形体模拟2型单纯疱疹病毒与寨卡病毒复制的研究

《Microbiology Spectrum》：Modelling herpes simplex virus type 2 and Zika virus replication in mouse vaginal organoids and human vaginal spheroids

中文翻译摘要 性传播病毒感染对女性健康影响尤为严重，并对孕产妇及胎儿健康产生不良后果。由于这些病毒通过阴道途径感染，阴道上皮是研究宿主-病毒相互作用的重要部位。近期建立了可被单纯疱疹病毒感染的小鼠阴道上皮类器官体外模型。本研究使用了多种阴道类器官系统，研究其对2型单纯疱疹病毒（HSV-2）和寨卡病毒（ZIKV）感染的应答，这两种病毒均可通过性传播并对孕产妇及胎儿健康造成不良影响。研究人员证明，小鼠阴道类器官支持HSV-2和ZIKV的复制，并能对干扰素（IFN）治疗产生应答。研究人员还从VK2/E6E7细胞建立了含明显顶侧和基底侧细胞层的人阴道球形体（human vaginal spheroids），这些球形体同样易受HSV-2和ZIKV感染。阿昔洛韦（acyclovir）处理降低了小鼠类器官和VK2球形体中的HSV-2复制。然而，瑞德西韦（remdesivir）在VK2球形体中抑制了ZIKV复制，但在小鼠类器官中无效，表明不同类器官系统中的抗病毒活性存在差异。最后，研究人员建立了顶侧朝外的小鼠阴道类器官，这些类器官同样易受HSV-2和ZIKV感染。总之，研究结果表明，阴道类器官和球形体是研究阴道病毒感染及抗病毒药物效应的有效体外模型。

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一、研究背景与科学问题

性传播病毒（sexually transmitted viruses, STVs）如人乳头瘤病毒（HPV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、单纯疱疹病毒（HSV）和寨卡病毒（ZIKV）是全球重大公共卫生问题，因其高发病率和不良生殖健康影响而备受关注。这些病毒对女性的影响尤为严重，常导致孕产妇、胎儿及新生儿的不良结局。除HPV外，尚无疫苗可用于预防这些感染，抗病毒药物也有限。因此，深入理解STVs的病毒-宿主互作机制至关重要。

阴道是女性STVs感染的主要途径，其表面覆盖复层鳞状上皮。尽管已有多种体内外模型用于研究女性生殖道发育和病理，包括三维（3D）类器官，但阴道类器官的应用仍十分有限，且尚无人阴道类器官模型。近期虽有小鼠阴道类器官建立并被证实对HSV感染易感，但其对其他病毒的易感性、对感染的免疫应答以及抗病毒药物的效应等诸多方面尚未明确。此外，基底朝外的极性取向对病毒致病性和宿主应答的影响也不清楚。

二、研究目的与研究内容

为探究上述特征，研究人员从小鼠组织生成了基底朝外和顶侧朝外的阴道类器官，并从转化的人阴道上皮细胞系VK2/E6E7生成了阴道球形体。三个系统均支持HSV-2和ZIKV复制。小鼠阴道类器官能够对HSV-2感染产生干扰素（IFN）应答。阿昔洛韦和瑞德西韦分别限制了HSV-2和ZIKV的复制。该工作揭示了阴道类器官的特征，有助于指导未来利用这些模型开展宿主-病原体互作研究。

三、关键技术方法

1. 1.
   原代小鼠阴道类器官培养：取经醋酸甲羟孕酮（DMPA）处理的雌性C57BL/6N小鼠阴道组织，经酶消化获取干细胞，重悬于基底膜提取物（BME）中，在含ROCK抑制剂、TGFβ受体激酶抑制剂和表皮生长因子（EGF）的培养基中培养形成类器官。
2. 2.
   人VK2球形体培养：将VK2/E6E7细胞重悬于BME，在含TGFβ受体激酶抑制剂和ROCK抑制剂的角质形成细胞无血清培养基（KSFM）中培养形成球形体。
3. 3.
   顶侧朝外小鼠阴道类器官建立：将基底朝外类器官从BME中释放，置于超低吸附板中悬浮培养，使极性翻转。
4. 4.
   病毒感染与抗病毒药物处理：以特定感染复数（MOI）感染类器官或球形体，加入200μM阿昔洛韦或10μM瑞德西韦，通过噬斑实验、ELISA检测NS1蛋白、RT-qPCR检测病毒基因和干扰素刺激基因（ISG）表达、免疫荧光共聚焦显微镜观察病毒蛋白定位。
5. 5.
   细胞活力检测：使用CellTiter-Glo 3D试剂检测药物处理后的细胞活力。

四、研究结果

1. 原代小鼠阴道类器官和人VK2球形的表征

研究人员从DMPA处理的小鼠阴道组织获得干细胞，培养7天后形成具明显基底层和棘层的类器官。HE染色显示明显的基底和顶侧细胞层。免疫荧光染色显示外层为增殖的Ki67⁺且表达p63的细胞，内层表达顶侧标志物丝聚合蛋白（filaggrin），E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达于整个类器官的细胞连接处，符合基底朝外极性。VK2细胞在2D培养中缺乏空间分化，但重悬于BME培养7-10天后形成球形结构，外层细胞表达Ki67和p63，内层细胞表达filaggrin，呈现类似基底朝外结构。

2. 阴道类器官和球形体对HSV-2感染易感且对抗病毒药物处理有应答

以MOI 1感染小鼠阴道类器官后，上清中HSV-2滴度在24和48小时显著升高；HSV-2晚期基因gC和gE及早期基因UL9表达增加（gE和UL9达显著水平）。免疫荧光显示HSV-2 gC蛋白聚集于基底层和棘上层细胞核周围。200μM阿昔洛韦处理显著降低48小时时类器官和VK2球形体中的HSV-2复制，且无明显细胞毒性。

3. ZIKV在小鼠阴道类器官和VK2球形体中复制，但药物敏感性存在种属差异

以MOI 1感染小鼠阴道类器官后，ELISA检测到NS1蛋白在24、48和72小时分泌增加；RT-qPCR显示NS5 RNA在48小时显著升高；免疫荧光检测到NS4B蛋白在感染类器官的多层细胞中表达。10μM瑞德西韦处理未影响小鼠类器官中ZIKV复制，但在VK2球形体中显著降低24小时的ZIKV滴度且无细胞毒性，48小时时虽伴有轻微细胞活力下降但仍持续降低病毒滴度，表明存在种属差异。

4. 小鼠阴道类器官具有完整的I型IFN应答

以50ng或100ng重组小鼠IFNα处理或不同MOI的HSV-2感染小鼠阴道类器官后，检测ISG表达。IFNα处理后，Mx1、Isg15、Rsad2和Ifit3的表达在12和24小时显著升高，Rsad2和Ifit3在6小时即显著升高。HSV-2感染在所有时间点引起四种ISG的适度（不显著）升高。表明类器官具有完整I型IFN应答通路。

5. 顶侧朝外小鼠阴道类器官的表征及其对HSV-2和ZIKV的感染

将基底朝外类器官从BME释放后悬浮培养，第3天开始翻转，第5天完全形成顶侧朝外类器官。HE染色显示大的中央腔隙和1-3层细胞环绕。免疫荧光显示p63和Ki67阳性细胞围绕腔隙，filaggrin表达于外侧细胞，与基底朝外类器官极性相反。顶侧朝外类器官需更高MOI（≥5）才能实现HSV-2和ZIKV的有效复制，可能与其Nectin-1表达较低且定位于基底/棘上层有关。

五、讨论与结论

讨论部分指出，该研究首次证明阿昔洛韦可阻断小鼠阴道类器官和人阴道球形体中的HSV-2复制，为筛选新型抗疱疹药物提供了保持阴道上皮结构复杂性且可规模化的替代模型。ZIKV在小鼠和人模型中复制水平相似，但瑞德西韦的抗病毒效果存在种属差异，可能与药物代谢差异有关。小鼠阴道类器官具有完整I型IFN信号通路，HSV-2感染引起的ISG表达较温和，反映了病毒ICP27拮抗IFN应答的能力。顶侧朝外类器官因极性翻转和Nectin-1表达降低而对HSV-2易感性下降，且培养基缺乏雌激素可能模拟了动情期样条件。该研究首次证明BME足以从人阴道细胞系生成3D球形体而不需旋转壁式生物反应器，且这些球形体表达顶侧和基底标志物并对HSV-2和ZIKV感染易感。

研究结论：研究人员证明了小鼠阴道类器官和人阴道球形体系统能够维持病毒复制并对抗病毒药物产生应答。这些结果有助于进一步表征这些近期建立的类器官，并提供额外证据表明它们可作为阴道病毒感染模型的潜力。