《Molecular Therapy Nucleic Acids》：lncRNA Lockd promotes cardiomyocyte proliferation via Eno1/beta-catenin/Myc axis
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新生小鼠心脏具有短暂的再生能力，可使其从损伤及某些病理性应激中恢复；然而，其对病理性肥厚刺激的反应仍定义不足。研究人员在此显示，处于再生窗口内的新生儿心脏可免受异丙肾上腺素（ISO）诱导的病理性肥厚并维持心脏功能，而超过该窗口的心脏则发生肥厚和功能损害。再生期
新生小鼠心脏具有短暂的再生能力，可使其从损伤及某些病理性应激中恢复；然而，其对病理性肥厚刺激的反应仍定义不足。研究人员在此显示，处于再生窗口内的新生儿心脏可免受异丙肾上腺素（ISO）诱导的病理性肥厚并维持心脏功能，而超过该窗口的心脏则发生肥厚和功能损害。再生期对肥厚应激的抵抗与强劲的心肌细胞增殖相关，而非再生期基本缺失该增殖。转录组分析鉴定长链非编码RNA（lncRNA）Lockd为再生窗口内上调最显著的转录本，且呈E2F1依赖方式。通过心肌细胞特异性AAV9介导在非再生期新生儿心脏过表达Lockd，可减轻ISO诱导的肥厚、维持心脏功能并恢复心肌细胞增殖能力。机制上，Lockd直接与α-烯醇化酶（ENO1）相互作用并稳定ENO1，导致β-catenin稳定性增强、核内蓄积及促增殖靶基因Myc诱导。一致地，敲低Eno1损害β-catenin信号、Myc表达和心肌细胞增殖。这些发现确定Lockd为新生儿心脏对病理性肥厚应激的再生抵抗的关键介导因子。
研究背景与问题：心血管疾病仍是全球死亡的主要原因，而成年哺乳动物心脏再生能力极低是心血管相关高死亡率的重要原因之一。低等脊椎动物如斑马鱼和蝾螈具有较高再生能力；人与小鼠、猪的新生儿心脏在应激后也可发生心脏再生并维持心功能。然而，现有聚焦神经-激素调节的心血管治疗并不促进心脏再生，难以提供永久治愈。因此，理解心脏再生机制并发现可成药新靶点具有未满足需求。既往研究显示，新生小鼠出生后第1天（P1）在心室心尖切除或心肌损伤后可完全再生，但该再生能力仅局限于约7天的狭窄窗口；P1小鼠心尖切除三周后丢失心肌区域可完全恢复，包括心肌细胞、血管和正常收缩功能；1日龄小鼠冠状动脉结扎导致约75%心肌丢失后三周也可完全再生并恢复收缩功能。Mohammadi等还显示再生期新生小鼠心脏可消除主动脉缩窄所致压力负荷效应。与成年小鼠不同，新生小鼠在压力负荷下表现出正常心功能。但新生儿心脏对异丙肾上腺素等病理性肥厚刺激的反应仍知之甚少。本研究旨在比较再生期与非再生期新生儿心脏对ISO的反应，并鉴定介导差异反应的关键分子。
研究人员开展的研究、结论与意义：研究人员证明，再生期新生儿心脏通过诱导心肌细胞增殖抵御ISO诱导的病理性肥厚和心力衰竭；非再生期心脏则因缺乏增殖能力而发生肥厚和心功能损害。机制上，研究人员鉴定lncRNA Lockd在再生心脏高表达，其过表达可通过刺激心肌细胞增殖挽救非再生心脏的ISO诱导心力衰竭；Lockd与ENO1结合并调控ENO1/β-catenin/Myc轴。该研究将Lockd确定为心肌细胞增殖的新型调控因子，并提示激活该轴可能有助于预防病理性心肌肥厚。
关键技术与样本来源（不超过250字）：研究使用新生C57BL/6J小鼠（由印度CSIR-CDRI国家实验动物中心提供；动物实验经IAEC/2021/95批准），建立再生期P1–P6与非再生期P10–P15的ISO皮下注射心肌肥厚模型，并用超声心动图、组织学、WGA细胞大小测量及Ki67、Aurora B、pH3免疫染色评估。采用转录组测序（RNA-seq）与基因本体（GO）分析筛选差异表达基因（DEG）；用心肌肌钙蛋白T（cTnT）启动子驱动的腺相关病毒9（AAV9）在心肌细胞特异性过表达Lockd或E2F1；用RNA Pull-down联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）、RNA免疫沉淀（RIP）、RNA电泳迁移率变动分析（RNA-EMSA）、重组ENO1与体外转录RNA验证直接结合；用环己酰亚胺（CHX）追踪检测蛋白稳定性，用短发夹RNA（shRNA）敲低ENO1，并在原代新生大鼠心肌细胞中验证。
研究结果：
（1）Regenerative hearts are protected from isoproterenol-induced cardiac hypertrophy and heart failure。研究人员在P1–P6（再生期）和P10–P15（非再生期）给予ISO，并分别于P7和P16评估。再生期心脏在ISO暴露后未见形态学改变，非再生期心脏发生肥厚；非再生期心脏重量/胫骨长度比（HW/TL）显著增加，心肌细胞面积显著增大，而再生期无变化。超声心动图显示非再生期ISO暴露后心功能显著下降并出现扩张，再生期心功能保持；肺湿重仅在非再生期显著增加，提示充血性心力衰竭；心脏重塑标志基因Nppa和Nppb仅在非再生期ISO处理后显著上调。增殖标志物Ki67、Aurora B激酶和pH3免疫染色显示，PBS处理的再生期心脏增殖心肌细胞多于非再生期，ISO进一步增加再生期增殖心肌细胞，而非再生期无变化。结论：再生期心肌细胞增殖潜能有助于减轻ISO病理效应，非再生期不能激活增殖则导致心功能异常和肥厚。
（2）Transcriptomic profiling of regenerative and non-regenerative hearts。研究人员对ISO暴露的再生期与非再生期心脏进行整体转录组分析，发现1085个基因差异表达（倍数变化≥2且校正p≤0.05）。GO富集分析显示，再生期相对非再生期上调转录本显著富集于细胞周期、DNA复制、有丝分裂、细胞周期检查点信号和丝分裂细胞周期G2/M期；下调转录本富集于肥厚型心肌病、心脏收缩、肌肉细胞细胞骨架和肌肉系统过程。Lockd为再生期与非再生期比较中上调最显著的转录本；实时PCR验证其在ISO暴露的再生期心脏显著高于非再生期。Lockd在小鼠心脏从P1至P7至P16进行性下调，随心肌细胞增殖下降；P16与成年心脏无差异，二者均失去增殖潜能。结论：再生期与非再生期心脏具有 distinct 转录组，Lockd与再生期增殖特征相关。
（3）Overexpression of E2F1 increases levels of Lockd during the non-regenerative phase。研究人员用真核启动子数据库扫描Lockd启动子（?2,000至+100 bp），预测159个转录因子可结合，进一步筛选具有一个以上结合位点者至69个，并与P7和P16心脏RNA-seq的DEG列表比对，发现仅E2f1在P16心脏较P7下调。实时PCR验证E2f1从P0至P7至P16进行性下降；E2F1与Lockd表达呈显著正相关；E2F1被预测在Lockd启动子有两个结合位点。研究人员在P1用cTnT启动子过表达E2F1，并在P16检测Lockd，发现E2F1过表达显著诱导P16心脏Lockd表达。结论：E2F1是Lockd表达的上游调控因子，其持续表达可在非再生期诱导Lockd。
（4）lncRNA Lockd overexpression induces cardiac regeneration in non-regenerative neonatal hearts。研究人员用cTnT启动子和AAV9在心肌细胞特异性过表达Lockd，P2皮下注射AAV9-Lockd，P10开始ISO，P16取材。AAV9-Lockd心脏Lockd显著增加，确认过表达。Lockd过表达可防止ISO诱导的心脏肥厚，表现为心脏形态改善、HW/TL显著降低、心肌细胞显著变小；并保持心脏功能，FS%和EF%在对照ISO组下降而在Lockd过表达组保留；ISO诱导的左心室舒张和收缩内径及容积增加在Lockd过表达后显著减轻；肺湿重和Nppa表达亦显著降低。Lockd过表达显著诱导心肌细胞增殖，Ki67+、pH3+和Aurora B激酶阳性心肌细胞增加。用AAV9-cTnT-GFP替代对照重复实验，GFP仅在心脏检测到，证实cTnT启动子心脏限制性；AAV9-cTnT-GFP小鼠在ISO后心功能异常与非病毒处理动物相当，而Lockd过表达小鼠心功能显著优于GFP组。主要器官组织学分析未见异常或组织损伤。无ISO处理时Lockd过表达也显著诱导增殖心肌细胞；在分离的新生大鼠心肌细胞中过表达Lockd亦诱导心肌细胞增殖。结论：Lockd诱导心肌细胞增殖，从而防止ISO诱导的肥厚和心功能异常。
（5）Lockd regulates ENO1/CTNNB1/MYC axis in cardiomyocytes。研究人员对ISO处理下对照与Lockd过表达心脏进行转录组分析，发现194个转录本差异表达（倍数变化≥2且校正p≤0.05），上调转录本在GO分析中富集于细胞周期和减数分裂细胞周期过程。为探索下游促增殖机制，研究人员用四条结合Lockd不同区域的反义寡核苷酸从P16 Lockd过表达心脏进行RNA Pull-down，实时PCR确认Lockd成功富集，LC-MS/MS鉴定出16个与Lockd结合的独特蛋白。将Lockd过表达后上调基因与Pull-down蛋白整合构建STRING网络并用Cytoscape和CytoHubba排序，Myc和Eno1位居前列。研究人员确认AAV9-Lockd心脏中Myc mRNA和蛋白上调，原代新生大鼠心肌细胞过表达Lockd也显著增加MYC。ENO1免疫沉淀显示Lockd显著富集，确认结合；纯化重组6×His标签ENO1与体外转录Lockd RNA进行结合实验，PCR仅ENO1与Lockd RNA共存时扩增Lockd，GFP RNA对照无扩增；RNA-EMSA显示ENO1使Lockd RNA发生清晰迁移率变动，过量未标记Lockd RNA可消除该结合，证明直接特异结合。CHX追踪显示Lockd过表达稳定ENO1；ENO1敲低显著降低心肌细胞增殖并下调Myc。Lockd过表达稳定β-catenin并促进其核转位，ENO1敲低加速β-catenin降解；β-catenin水平从P0至P7至P16显著下降。结论：Lockd通过ENO1/β-catenin/Myc轴介导心肌细胞促增殖效应。
讨论总结：新生儿小鼠心脏因再生潜能可逃避多种应激所致病理重塑；本研究显示其通过诱导心肌细胞增殖防止ISO所致肥厚并保持心功能，但该有益特征局限于再生窗口。类似效应已在主动脉缩窄模型观察到，提示再生期新生儿心脏具有预防病理性心肌肥厚的能力。多个lncRNA已被证明调控心肌细胞增殖，如MALAT1控制心脏再生窗口与心肌细胞增殖及双核化，UCA1在新生和成年小鼠中诱导心肌细胞增殖，NPPA-AS1缺失延长心肌细胞增殖窗口；本研究鉴定Lockd为心肌细胞增殖的新型调控因子，并显示其在非再生期过表达可延长增殖窗口、改善ISO病理效应。Cui M等利用新生儿心脏单核RNA-seq显示Lockd在心肌细胞亚群CM4高表达，该亚群在心肌缺血后增殖，且再生期数量高于非再生期；Lockd亦被证明促进骨骼肌成肌细胞增殖和肌肉再生，支持其作为肌细胞增殖诱导因子。ENO1除酶功能外可作为RNA结合蛋白结合多种lncRNA，本研究进一步确认其非酶功能。Lockd激活β-catenin信号并增加Myc；Hao等显示KLF1通过激活β-catenin/myc轴促进心肌细胞增殖，Lee等显示激活β-catenin信号通路可促进人iPS-心肌细胞无接触增殖，N-cadherin亦通过激活β-catenin信号促进心肌细胞增殖；与本研究类似，再生期P1心脏β-catenin水平高于非再生期P21和成年心脏。研究结论部分翻译：总之，研究人员的研究揭示，仅处于再生阶段的新生儿心脏可通过促进心肌细胞增殖减轻肥厚诱导剂异丙肾上腺素（ISO）的病理性效应；此外，研究人员鉴定lncRNA Lockd为心肌细胞增殖的新型调控因子。
