gC缺失重组PRV-XJ变异株的构建及其不同接种途径下小鼠疾病结局差异

《Microbiology Spectrum》：Characterization of a recombinant gC-deleted PRV-XJ variant reveals altered disease outcomes following different inoculation routes in mice

　　

伪狂犬病毒（PRV）变异株持续威胁猪生产，并可在非天然宿主中引起严重神经疾病。虽然糖蛋白C（gC）有助于PRV附着宿主细胞，但其在当前流行PRV变异株致病特征中的作用仍不清楚，尤其是在不同接种途径下。本研究基于基因II型（genotype II）PRV-XJ变异株构建了无标记gC缺失重组病毒rPRV-XJ-ΔgC，并在C57BL/6小鼠中比较其与亲本PRV-XJ的致病特征。rPRV-XJ-ΔgC保留致死感染能力，但与PRV-XJ相比，表现出疾病进展延迟、早期中枢神经系统（CNS）病毒累积减少以及神经和神经病理改变较轻，尤其在鼻内接种后。这些差异在肌内接种后较不明显。rPRV-XJ-ΔgC鼻内感染还与血脑屏障（BBB）破坏减轻相关，与CNS损伤减少一致。总之，这些发现表明PRV-XJ背景中的gC缺失与感染动力学改变和途径依赖性CNS疾病表型相关。重要性：伪狂犬病毒（PRV）变异株仍是与神经疾病相关的重要病原体，但单个病毒基因对当前流行PRV变异株致病特征的贡献仍知之甚少。在此，研究人员探讨了糖蛋白C（gC）在基因II型PRV-XJ变异株致病表型中的作用。gC缺失导致PRV-XJ诱导的疾病结局发生途径依赖性变化，鼻内接种后效应比肌内接种更明显。这些发现强调病毒遗传因素和感染途径在塑造PRV相关疾病表型中的重要性，并为PRV神经发病机制提供进一步见解。

论文主体部分解读：伪狂犬病由伪狂犬病毒（PRV，属于α疱疹病毒亚科的Varicellovirus属）引起，主要表现为发热、呼吸道症状和神经功能障碍。猪是PRV的主要自然宿主和重要传播储库，给养猪业造成经济损失；现有疫苗可降低临床疾病和死亡，但不能完全阻止感染、潜伏和传播。中国基因II型PRV变异株的出现及野猪等持续储库使防控复杂化；人PRV感染主要与职业暴露相关，常涉及严重神经表现，从脑脊液分离人PRV株进一步提示其在非天然宿主中的神经侵袭潜力。gC由UL44编码，是主要附着因子，可与细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）相互作用，促进病毒吸附和早期感染；但gC在当前流行PRV变异株致病特征中的作用，尤其在不同接种途径下，仍不清楚。接种途径也是PRV疾病严重程度的重要决定因素，实验模型中鼻内感染通常较肌内接种引起更明显神经表现；C57BL/6小鼠对PRV诱导的神经病理损伤和血脑屏障（BBB）破坏易感。因此，研究人员以基因II型PRV-XJ变异株为亲本构建无标记gC缺失重组病毒rPRV-XJ-ΔgC，并在C57BL/6小鼠中比较鼻内和肌内接种后的致病特征，重点观察疾病进展、CNS病毒分布和神经病理改变。研究结论表明，rPRV-XJ-ΔgC仍可致死感染，但较亲本PRV-XJ表现为疾病进展延迟、早期CNS病毒累积减少、神经病理损伤较轻和BBB破坏较不明显，尤其鼻内接种后；这些差异在肌内接种后通常较不明显。该研究提示gC缺失在PRV-XJ背景中与感染动力学改变和途径依赖性CNS相关疾病表型相关，为理解PRV神经发病机制及病毒遗传因素和感染途径对疾病表型的影响提供依据。

关键技术方法（不超过250字）：PRV-XJ株分离自中国四川省某PRV免疫猪场死亡仔猪脑组织（GenBank MW893682.1），C57BL/6小鼠购自北京华阜康。研究人员以PRV-XJ为亲本，采用两步CRISPR/Cas9介导同源重组构建无标记gC（UL44）缺失重组病毒rPRV-XJ-ΔgC，经PCR、测序、Western blot、斑块试验、生长动力学和透射电镜验证。在C57BL/6小鼠中测定鼻内和肌内接种的半数致死量（LD₅₀），并以5 × 10⁵ TCID₅₀/只比较存活、临床神经评分、CNS病毒载量、脑病理、BBB通透性及紧密连接蛋白表达。

结果：（1）rPRV-XJ-ΔgC的构建与鉴定（Construction and characterization of rPRV-XJ-ΔgC）：通过两步CRISPR/Cas9同源重组先获得EGFP标记中间病毒，再切除报告基因获得无标记rPRV-XJ-ΔgC；PCR、测序和Western blot确认gC缺失且TK、gI、gE、gB保留，21代传代稳定；斑块试验、生长动力学和透射电镜显示其可形成斑块，峰值滴度分别为7.71和7.22 lg TCID₅₀/0.1 mL，病毒粒子形态无明显差异，结论为成功构建遗传稳定的无标记gC缺失重组病毒。（2）PRV-XJ和rPRV-XJ-ΔgC感染的临床与病理特征（Clinical and pathological characterization of PRV-XJ and rPRV-XJ-ΔgC infection）：LD₅₀测定显示鼻内接种PRV-XJ和rPRV-XJ-ΔgC分别为10^?5.5/0.02 mL和10^?4.5/0.02 mL，肌内接种分别为10^?5.31/0.2 mL和10^?4.76/0.2 mL，rPRV-XJ-ΔgC保留致死潜力；以5 × 10⁵ TCID₅₀接种后，鼻内PRV-XJ组死亡始于48 hpi、72 hpi达100%，rPRV-XJ-ΔgC组死亡始于第4天、第6天全部达终点；肌内接种两组均致死但生存差异较不明显；濒死期脑和肺病变在鼻内rPRV-XJ-ΔgC组较轻，肌内两组相当，结论为gC缺失后疾病衰减在鼻内接种更明显。（3）神经症状与CNS病毒载量（Neurological signs and CNS viral loads）：鼻内PRV-XJ感染小鼠出现抓鼻、蹭笼、弓背、转圈、呼吸困难、震颤、嗜睡及偶发眼鼻出血，rPRV-XJ-ΔgC组发病延迟且24 hpi无临床体征；鼻内接种后24、48、72 hpi rPRV-XJ-ΔgC组神经评分显著低于PRV-XJ组（P<0.01），肌内接种后相同时间点也较低；鼻内接种24 hpi rPRV-XJ-ΔgC组在延髓、小脑、脑桥、下丘脑、海马和大脑皮质病毒载量显著较低（P<0.01），嗅球两组均低；濒死期差异不一致，rPRV-XJ-ΔgC组嗅球和脑桥较高、下丘脑较低；肌内接种后多数脑区相当；动态分析显示鼻内早期脑病毒载量较低、后期部分脑区增加，结论为鼻内感染后神经表现延迟和早期CNS病毒载量降低，肌内差异较不明显。（4）脑病理与神经元损伤（Brain pathology and neuronal injury）：濒死期脑组织大体、H&E、gB免疫组化、Nissl和TUNEL分析显示，鼻内PRV-XJ组脑异常更明显，包括充血、水肿、脑膜血管扩张和散在出血，rPRV-XJ-ΔgC组较轻，肌内两组大体改变相当；H&E病变鼻内rPRV-XJ-ΔgC组较轻，肌内差异不明显；gB免疫组化信号在两种途径下rPRV-XJ-ΔgC组均降低（P<0.01）；Nissl染色显示鼻内rPRV-XJ-ΔgC组神经元形态较保留、Nissl阳性神经元增多（P<0.01），肌内无显著差异；TUNEL显示两种途径下rPRV-XJ-ΔgC组凋亡细胞均较少，结论为PRV相关脑病理和神经元损伤模式不同，鼻内差异更明显。（5）BBB完整性与紧密连接蛋白（BBB integrity and tight junction proteins）：Evans blue渗出、免疫荧光和Western blot显示，鼻内PRV-XJ组EB漏出增加主要在大脑皮质，rPRV-XJ-ΔgC组减少但仍高于mock；肌内两组均在小脑和大脑皮质漏出但低于鼻内PRV-XJ组；定量显示鼻内rPRV-XJ-ΔgC组EB含量显著较低（P<0.01），肌内无显著差异；免疫荧光显示鼻内PRV-XJ组ZO-1和occludin信号减少且不连续，rPRV-XJ-ΔgC组相对保留但仍低于mock；肌内两组均减少且不连续、差异有限；Western blot显示鼻内rPRV-XJ-ΔgC组ZO-1和occludin显著高于PRV-XJ组（P<0.01）但仍低于mock，肌内差异较不明显而感染组均低于mock（P<0.01），结论为BBB相关变化两组不同，鼻内差异更明显。

讨论部分总结：基因II型PRV变异株在中国猪群持续存在，对经典Bartha-K61疫苗保护构成挑战；人PRV散发病例主要与职业暴露相关，提示流行株在非天然宿主中的神经疾病潜力。gC是囊膜糖蛋白，通过与细胞表面HSPGs相互作用参与PRV初始附着，可能影响不同细胞和组织环境中的感染效率，但gC在当前流行PRV变异株中的作用，尤其与感染途径依赖性CNS受累和神经病理变化的关系，仍未充分明确。本研究显示rPRV-XJ-ΔgC仍可在C57BL/6小鼠中致死，但疾病进展延迟，鼻内接种后更明显，表现为神经表现延迟、早期CNS病毒载量较低以及濒死期脑病理和BBB相关改变减轻。PRV经外周神经元通路进入CNS，鼻内感染可能涉及三叉、交感、副交感途径及神经环路跨神经元传播；肌内感染需外周复制、神经末梢进入和神经元运输后向CNS播散，这些不同神经侵袭过程可能 contribute to 途径相关差异。由于两种途径LD₅₀不同，同一接种量不代表等价暴露，数据仅说明当前实验条件下gC缺失相关表型差异在鼻内接种后更明显。rPRV-XJ-ΔgC在两种途径仍具致病性，提示gC缺失未消除PRV-XJ致病性，而主要影响感染进展和动力学。濒死期部分脑区病毒DNA较高可能反映疾病动力学差异和较长神经环路传播时间，而非复制能力增强，因两组濒死组织采集时间不同。BBB破坏是PRV诱导CNS损伤的重要特征，HSPGs在内皮糖萼中丰富并参与BBB完整性，gC介导初始附着，gC缺失可能改变早期病毒—内皮相互作用，但BBB相关表型是gC缺失直接效应还是病毒播散和宿主反应改变的继发结果尚不清楚。研究局限包括gC贡献这些表型的确切机制未明，病毒附着、进入、轴突运输、跨神经元传播和宿主反应等未直接检测，未来需阶段特异性感染模型及转录组、蛋白组等研究。研究结论翻译：总之，研究人员基于基因II型PRV-XJ变异株构建了无标记gC缺失重组病毒rPRV-XJ-ΔgC，并在C57BL/6小鼠中评价其致病特征。rPRV-XJ-ΔgC保留致死感染能力，但与亲本PRV-XJ相比，尤其在鼻内接种后，表现出疾病进展延迟、早期CNS病毒累积减少、神经病理损伤较轻和BBB破坏较不明显；这些差异在肌内接种后通常较不明显。总体而言，这些发现提示在PRV-XJ背景中，gC缺失与感染动力学改变和途径依赖性CNS相关疾病表型相关。