基于生物活性脱细胞细胞外基质的负载甲钴胺芯鞘神经导管用于周围神经再生

《Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects》：Bioactive dECM-based Core-sheath Nerve Guidance Conduit Loaded with Mecobalamin for Peripheral Nerve Regeneration

　　外周神经损伤（PNI）仍是一项重大的临床挑战，目前使用自体神经移植物作为金标准仍存在供区并发症和移植物稀缺等局限性。本研究开发了一种仿生核-鞘结构神经引导导管（NGC），将生化信号与导电性及力学性能相结合，以促进外周神经再生。核部分由dECM-G@mZif-8水凝胶制备而成，采用甲基丙烯酰化明胶（GelMA）与脱细胞细胞外基质（dECM）双交联，原位掺入载甲钴胺的Zif-8（mZif-8）纳米颗粒。外鞘采用还原氧化石墨烯增强的聚己内酯（rGO@PCL）通过电纺丝技术制成，提供导电性和足够的机械强度。dECM-G@mZif-8水凝胶表现出甲钴胺的持续释放、优异的细胞相容性，并促进PC12细胞黏附和迁移。大鼠坐骨神经缺损模型证实，所制备的核-鞘NGC取得了与自体移植物法相当的功能效果，包括神经再生、髓鞘化、肌肉再神经化和电生理恢复的增强。髓鞘碱性蛋白和β-微管蛋白免疫荧光分析进一步证实了髓鞘形成和轴突再生。这种多功能导管结合了基于dECM的核水凝胶、导电rGO@PCL鞘和甲钴胺持续递送，在外周神经修复中展现出良好的临床前潜力。外周神经损伤（PNI）仍是一个重要的全球性临床挑战，每年影响约十万分之十三至二十三个人，并常导致疼痛性神经病变、活动能力丧失、感觉功能障碍，甚至瘫痪[1]。外周神经的自发再生往往不足以恢复功能。目前，自体神经移植仍是修复外周神经缺损的临床金标准，因为自体移植物可提供理想的结构引导、细胞外基质（ECM）成分和神经营养支持相结合，促进轴突再生和目标再神经化[2]，[3]。然而，这种自体移植方法受到诸多局限性的严重制约，如供区并发症、潜在的束不匹配以及需要第二手术部位。人工神经引导导管（NGCs）已作为一种有前景的治疗策略出现。理想的NGC应具备多种期望特性，包括生物相容性、可生物降解性、机械稳定性、柔韧性和对营养物质及信号分子的通透性[4]。常规中空NGC无法充分复制天然神经ECM复杂的生化、地形学和电信号，因此导致雪旺细胞迁移不足、轴突再生紊乱和功能恢复不佳[5]。为了重现天然外周神经的分级结构，核-鞘结构导管作为一种高级的外周神经修复策略已被开发出来[6]。核-鞘结构具有几个独特优势：内核为轴突生长提供生化和地形学引导，外鞘提供机械支撑、结构完整性和保护[7]。核和鞘材料之间的协同作用已被证明可增强雪旺细胞迁移、促进髓鞘形成，并在坐骨神经损伤动物模型中改善功能恢复[6]。此外，核-鞘构型便于治疗药物的时空递送。例如，载药纳米颗粒或生长因子可原位掺入核中以实现持续、受控释放，为再生的轴突提供长期的神经营养支持[8]。鞘部分可采用电纺丝技术制造，以模拟天然ECM的拓扑形态，为轴突定向生长提供接触引导[9]。脱细胞细胞外基质（dECM），由组织或器官来源的基质制备而成，已发展成为一种变革性的生物材料，用于外周神经再生，因为dECM保留了天然蛋白、糖胺聚糖和生物活性分子的复杂组合[10]，[11]。在外周神经再生中，来自不同组织（如肌腱、脐带等）的dECM提供了生物活性储库，可深刻影响雪旺细胞行为、轴突再生和功能恢复[10]。近期研究表明，整合dECM的导管不仅可促进神经细胞的迁移、增殖和分化，还可改善神经微环境、减少炎症反应并促进血管新生，这些都是神经再生成功的关键[12]，[13]。甲钴胺（维生素B12的活性形式）已成为一种有前景的治疗药物，用于促进外周神经再生[14]，[15]。损伤部位过度的氧化应激、炎症以及不足的神经营养支持常常阻碍外周神经修复，甲钴胺可能通过影响关键的细胞和分子过程来解决这些障碍[14]。研究表明，甲钴胺可通过增强神经传导速度、刺激轴突生长和促进再髓鞘化来促进受损神经的再生[16]，[17]。近期研究表明，甲钴胺可调节神经修复过程中的肌动蛋白细胞骨架，并上调肌动蛋白细胞骨架通路中的Vav1[17]。然而，甲钴胺的生物利用度低和半衰期短，需要局部和持续递送策略[15]。当将其掺入水凝胶或纳米载体系统时，甲钴胺可在损伤部位逐渐释放，为再生的轴突提供长期的神经营养支持[18]。本研究开发了一种核-鞘结构NGC，在单一分级结构中协同整合了生化、生物物理和电信号（图1）。由甲基丙烯酰化明胶（GelMA）与dECM双交联组成的生物活性水凝胶核提供了类原生细胞外微环境，主动支持神经细胞黏附和迁移。此外，通过将载甲钴胺的Zif-8（mZif-8）纳米颗粒封装于水凝胶核中，引入了一种持续药物递送系统，在减轻重复给药需求的同时，为再生的轴突提供长期的神经营养支持。外鞘由电纺还原氧化石墨烯增强的聚己内酯（rGO@PCL）制成，赋予导管优异的导电性、增强的机械强度和改善的亲水性。据我们所知，这种NGC将基于dECM的水凝胶核与rGO@PCL导电鞘和载甲钴胺的金属有机框架纳米颗粒相结合，用于外周神经修复。在大鼠坐骨神经缺损模型中的全面体内评估表明，我们的导管取得了与自体移植物相当的多功能性效果。明胶（Gel，目录号：10010326）、氢氧化钠（NaOH）、乙酸（CH?COOH，HAc）和盐酸（HCl）购自国药化学试剂有限公司（中国上海）。N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和聚己内酯（PCL，Mw = 800000）购自Sigma-Aldrich公司。甲基丙烯酸酐（C?H??O?）、2-甲基咪唑、乙酸锌二水合物、聚己内酯（PCL，Mw = 800000）作为一种典型的金属有机框架材料，Zif-8纳米颗粒因其高多孔结构和广泛的内部微孔腔体而适合药物递送[22]。本工作中，首先合成了Zif-8纳米颗粒作为药物载体，然后负载甲钴胺——一种具有神经保护和再生特性的维生素B12生物活性形式[16]，以获得mZif-8纳米颗粒。Zif-8和mZif-8纳米颗粒的形态特征通过TEM进行了表征（总之，我们成功开发了一种多功能核-鞘结构神经引导导管（NGC），将生物活性dECM基水凝胶核与导电rGO@PCL鞘相结合。将载甲钴胺的mZif-8纳米颗粒掺入水凝胶核中实现了持续药物释放，解决了损伤部位局部长期治疗递送的关键需求。电纺rGO@PCL鞘赋予优异的导电性和增强的赵英松：撰写 – 审阅与编辑，形式分析，数据整理。崔月鑫：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，软件，形式分析。聂雷：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，监督，软件，项目管理，方法论，资金获取，形式分析，概念构思。严立兆：撰写 – 审阅与编辑，形式分析，数据整理。刘双：撰写 – 审阅与编辑，软件，方法论，形式分析，作者声明他们不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所述工作的客观性。本研究受国家自然科学基金（32571576）、信阳师范大学南湖青年学者计划资助。作者感谢信阳师范大学分析测试中心的支持。作者声明他们不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所述工作的客观性。聂雷|崔月鑫|李先炎|刘双|严立兆|赵英松